美洲品系葡萄叶多酚的提取工艺优化及抗氧化活性研究

2016-12-01 06:32罗英花王晓微臧延青金成浩
黑龙江八一农垦大学学报 2016年4期
关键词:超氧美洲茶多酚

罗英花,王晓微,臧延青,金成浩

(1.黑龙江八一农垦大学动物科学技术学院,大庆163319;2.黑龙江八一农垦大学食品学院;3.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院)

美洲品系葡萄叶多酚的提取工艺优化及抗氧化活性研究

罗英花1,王晓微2,臧延青2,金成浩3

(1.黑龙江八一农垦大学动物科学技术学院,大庆163319;2.黑龙江八一农垦大学食品学院;3.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院)

以美洲品系葡萄叶为原料,研究提取液浓度、温度、时间及料液比对多酚提取率的影响,通过正交实验优化工艺条件,并对体外抗氧化效果进行了研究。结果表明:最佳工艺条件为乙醇浓度50%,浸提温度70℃,浸提时间60 min,料液比1∶15,多酚提取率可达1.72%。美洲品系葡萄叶多酚对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、羟基自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O2-·)具有良好的清除能力,其清除率在样品浓度为1.0 mg·mL-1时,分别为L9:87.74%、64.92%和65.00%;L10:86.15%、58.00%和51.20%。

多酚;美洲品系葡萄叶;提取;自由基;抗氧化活性

植物多酚(Plant polyphenols)是一类分子结构中含有酚官能团的化合物[1],属于植物的次生代谢产物,广泛存在于植物的皮、根、茎、叶及果实中。国内外学者研究发现,植物多酚具有多种生物学活性,如抗氧化、抗肿瘤、抗真菌、抗病毒、抗辐射等活性,它可以清除体内代谢过程中产生的自由基,具有延缓机体衰老和心脑血管疾病的功效[2-5]。此外,多酚物质还可用于制作除臭剂、防锈剂和废水处理剂等[6-8]。因此,植物多酚在食品、医疗保健、日用化工、生态保护及农业防害等诸多领域中具有很高的利用价值,已成为当前研究的热点。

关于葡萄多酚物质的提取、测定、干燥及其抗氧化性、保健功能等方面的研究较多,这些研究的材料主要是葡萄皮(提取率2%~6.97%)和葡萄籽(提取率13.3%)[9-10],但对葡萄植株其他材料多酚物质的研究才刚刚开始,尚未系统进行。葡萄在夏季管理中经常进行摘心、抹芽、除副梢、剪枝等,要扔掉大量的材料,尤其是秋季葡萄成熟采摘后的葡萄植株几乎全部废弃,如果能够从这些废弃的材料中提取有效的生物活性物质,使其变废为宝,将会大大提高葡萄栽培的效益[11]。

研究利用正交实验法优化美洲品系葡萄叶多酚的提取工艺,并进一步测定其抗氧化活性,旨在对葡萄叶多酚的开发利用提供理论基础,同时也为开发天然防癌、防衰老食品提供可利用的原料资源。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

美洲品系葡萄叶(L9(Noah)、L10(Sweson))由黑龙江省龙垣农业科技开发有限公司提供,采摘于2013年10月。

Folio-Denis、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)试剂购自美国sigma公司;焦性没食子酸、邻苯三酚、水杨酸、过氧化氢、邻菲啰啉、邻二氮菲、硫酸亚铁等常规化学试剂皆为国产分析纯。

1.2 主要仪器与设备

UV-2550型紫外可见分光光度计(紫尤尼柯上海仪器有限公司),KH3200DE型数控超声波清洗器(上海沪粤明科学仪器有限公司),TD4A台式离心机(长沙英泰仪器有限责任公司),HH-1数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司),DGG-9140B型电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司),SHB-ⅢA循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 葡萄叶多酚提取

将新鲜葡萄叶去杂,清水漂洗并沥干水分,阴干后粉碎,过60目筛,准确称取1 g葡萄叶,于60℃条件下加入50%乙醇(料液的质量与体积比为1∶10),回流提取1 h,布氏漏斗进行减压抽滤,滤渣按上述步骤重复两次,将两次滤液合并,在常温下离心(3 500 rpm·min-1),取上清液获得多酚粗提物。

1.3.2 标准曲线的制作

取没食子酸样品,准确配制浓度为0.2 mg·mL-1的没食子酸(标准品)溶液,分别取上述标准溶液0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 mL于50 mL容量瓶中,加入3.0 mL Folin-Denis(稀释一倍)试剂,混合摇匀;放置3 min,加入3.0 mL 10%Na2CO3,混合摇匀,于室温下放置1 h,利用紫外可见分光光度计在760 nm波长下测定吸光度值。以标准品溶液浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。

1.3.3 葡萄叶多酚含量的测定

按照1.3.1节方法提取多酚,将提取液按1∶10(体积比)稀释,准确吸取0.5 mL于50.0 mL容量瓶中,加入3.0 mL Folin-Denis(稀释一倍)试剂,混合摇匀;放置3 min,加入3.0 mL 10%Na2CO3,混合摇匀,于室温下放置1 h,利用紫外可见分光光度计在760 nm波长下测定吸光度。根据没食子酸标准曲线获得多酚含量,计算多酚提取率。

式中C0为样液浓度(mg·L-1);V0为定容后体积(mL);V1为测定时样液体积(mL);V2为测定吸光度时所用样液体积(mL);w为称取葡萄叶粉末质量(mg)。

1.3.4 美洲品系葡萄叶多酚提取的单因素实验

1.3.4.1 乙醇浓度对美洲品系葡萄叶多酚提取的影响

称取葡萄叶粉末1 g,料液比为1∶10,提取温度70℃,浸提1 h,浸提试剂的乙醇体积分数选取6个不同水平(30%、40%、50%、60%、70%、80%),研究乙醇浓度对多酚提取率的影响。

1.3.4.2 浸提时间对美洲品系葡萄叶多酚提取的影响

称取葡萄叶粉末1 g,浸提试剂为50%乙醇水溶液,料液比为1∶10,提取温度70℃,浸提时间分别选取6个不同水平(30、45、60、75、90、105 min),研究浸提时间对多酚提取率的影响。

1.3.4.3 浸提温度对美洲品系葡萄叶多酚提取的影响

称取葡萄叶粉末1 g,浸提试剂为50%乙醇水溶液,料液比为1∶10,浸提时间1 h,浸提温度分别选取6个不同水平(30、40、50、60、70、80℃),研究浸提温度对多酚提取率的影响。

1.3.4.4 料液比对美洲品系葡萄叶多酚提取的影响

称取葡萄叶粉末1 g,浸提试剂为50%乙醇水溶液,提取温度70℃,浸提时间1 h,料液比(葡萄叶质量/乙醇体积)分别选取6个不同水平(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30),研究料液比对多酚提取率的影响。

1.3.5 美洲品系葡萄叶多酚提取的正交实验

在单因素实验结果基础上选取乙醇浓度、浸提时间、浸提温度、料液比为4个因素,以美洲品系葡萄叶中多酚提取率为考察指标,用L9正交表安排试验,得出最佳浸提条件。

表1 正交实验因素水平表Table 1Experimental factors and levels of the orthogonal array design

1.3.6 美洲品系葡萄叶多酚的抗氧化活性测定

1.3.6.1 美洲品系葡萄叶多酚清除DPPH自由基能力的测定

准确配置0.10 mmol·L-1DPPH溶液。不同浓度(分别为25、50、75、100、125 μg·mL-1)的多酚溶液,加入3 mL在室温下反应5 min,测定519 nm处吸光度值。

式中A2为不加待测液时反应体系的吸光度值;A1为加入待测液时反应体系的吸光度值。

1.3.6.2 美洲品系葡萄叶多酚清除羟基自由基(·OH)能力的测定

采用邻二氮菲-Fe2+氧化法[12]。取4 mL 0.075 mmol·L-1的磷酸盐缓冲液(pH 7.4),加入1.5 mL 0.5 mmol·L-1的邻二氮菲溶液,充分混匀;加入1 mL 0.75 mmol·L-1的Fe2SO4溶液,立即混匀;加入2 mL浓度分别为25、50、75、100、125 μg·L-1的多酚溶液,立即混匀;再加入1.5 mL双蒸水以补充体积;最后加入1.0 mL浓度为1%的H2O2溶液,轻轻混匀;在37℃反应60 min,测定510 nm处吸光度值。

式中:A0为空白对照液吸光度值;Ax为加入多酚溶液后吸光度值;Ax0为多酚溶液本底吸光度值。

1.3.6.3 美洲品系葡萄叶多酚清除超氧阴离子(O2-)能力的测定

取5 mL 0.075 mmol·L-1的磷酸盐缓冲液(pH 8.2),加入2 mL浓度分别为25、50、75、100、125 μg·mL-1多酚样液,置于25℃水浴中预热20 min。加入已预热的4.50 mmol·L-1邻苯三酚0.10 mL,混匀后置于25℃水浴中反应4 min,用8.00 mol·L-1HCl终止反应。用双蒸水调节仪器零点,在420 nm处测定吸光度值,读数为A1。以离子水取代邻苯三酚,获得吸光度值记为A2。以离子水取代样品,获得吸光度值标记为A3。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线的建立

如图1所示,没食子酸在浓度0~8 μg·mL-1内与其吸光度值呈良好的线性关系,回归方程为y=0.172 6x-0.002 7,相关系数R2=0.992 1。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1The standard curve of gallic acid

2.2 美洲品系葡萄叶多酚提取的单因素试验结果分析

2.2.1 乙醇浓度对美洲品系葡萄叶多酚提取率的影响

如图2所示,随着浸提试剂乙醇浓度的增加,美洲品系葡萄叶多酚的提取率呈先增后减的趋势,当乙醇浓度为60%时美洲品系葡萄叶多酚提取率达到最高值。

2.2.2 浸提时间对美洲品系葡萄叶多酚提取率的影响

如图3所示,随着浸提时间的增加,美洲品系葡萄叶多酚的提取率呈先增后减的趋势,当浸提时间达到60 min时,美洲品系葡萄叶多酚提取率达到最高值。

图2 乙醇浓度对美洲品系葡萄叶多酚提取率的影响Fig.2Effect of ethanol concentration on yield of polyphenol from American strain of grape leaves

图3 浸提时间对美洲品系葡萄叶多酚提取率的影响Fig.3Effect of extraction time on yield of polyphenol from American strain of grape leaves

2.2.3 浸提温度对美洲品系葡萄叶多酚提取率的影响

如图4所示,随着浸提温度的升高,美洲品系葡萄叶多酚的提取率呈先增后减的趋势,当浸提温度达到70℃时,美洲品系葡萄叶多酚提取率达到最高值。

2.2.4 料液比对美洲品系葡萄叶多酚提取率的影响

如图5所示,随着浸提试剂容量的增加,美洲品系葡萄叶多酚的提取率呈先增后减的趋势,当料液比达到1∶20时,美洲品系葡萄叶多酚提取率达到最高值。

图4浸提温度对美洲品系葡萄叶多酚提取率的影响Fig.4Effect of extraction temperature on yield of polyphenol from American strain of grape leaves

图5 料液比对美洲品系葡萄叶多酚提取率的影响Fig.5Effect of material/liquid ratio on yield of polyphenol from American strain of grape leaves

2.3 美洲品系葡萄叶多酚提取的正交试验结果分析

如表2所示,影响美洲品系葡萄叶多酚提取效果的主次顺序为A>B>C>D,即乙醇浓度>浸提时间>浸提温度>料液比。由k值分析可知,美洲品系葡萄叶多酚提取的最佳方案为A2B2C2D1,即乙醇浓度50%、浸提时间60 min、浸提温度70℃、料液比1∶15时,美洲品系葡萄叶多酚提取的效果最好(表1),多酚提取率可达1.72%。

表2 正交实验设计及结果Table 2Orthogonal array design and results

续表2正交实验设计及结果Continued table 2Orthogonal array design and results

2.4 美洲品系葡萄叶多酚的抗氧化活性

2.4.1 美洲品系葡萄叶多酚对DPPH自由基的清除作用

如图6所示,L9、L10品系的葡萄叶和茶多酚对DPPH自由基的清除率随溶液质量浓度的增加而增大。DPPH自由基半抑制剂量(IC50)分别是L9型葡萄叶多酚为0.151 6 mg·mL-1;L10型葡萄叶多酚为0.229 5 mg·mL-1;茶多酚为0.296 8 mg·mL-1。由此可见,三者对DPPH的清除能力与浓度之间存在量效关系,且L9与L10型葡萄叶对DPPH自由基的清除效果都优于同浓度茶多酚,L9葡萄叶多酚对DPPH自由基的清除能力是茶多酚的1.96倍,L10葡萄叶多酚对DPPH自由基的清除能力是茶多酚的1.29倍,即L9>L10>茶多酚。

图6 美洲品系葡萄叶多酚(L9、L10)对DPPH自由基清除作用Fig.6Effect of polyphenol from American strain of grape leaves on DPPH radical inhibition

2.4.2 美洲品系葡萄叶多酚对羟基自由基(·OH)的清除作用

如图7所示,L9、L10品系的葡萄叶和茶多酚对羟基自由基的清除率随溶液质量浓度的增加而增大。羟基自由基半抑制剂量(IC50)分别是L9型葡萄叶多酚为0.850 3 mg·mL-1;L10型葡萄叶多酚为0.955 mg·mL-1;茶多酚为0.997 4 mg·mL-1。由此可见,三者对羟基自由基的清除能力与浓度之间存在量效关系,且L9与L10型葡萄叶对羟基自由基的清除效果都优于同浓度茶多酚,L9葡萄叶多酚对羟基自由基的清除能力是茶多酚的1.17倍,L10葡萄叶多酚对羟基自由基的清除能力是茶多酚的1.03倍,即L9>L10>茶多酚。

图7 美洲品系葡萄叶多酚(L9、L10)对羟基自由基的清除作用Fig.7Effect of polyphenol from American strain of grape leaves on superoxide anion inhibition

2.4.3 美洲品系葡萄叶多酚对超氧阴离子(O2-)的清除作用

如图所示,L9、L10品系的葡萄叶和茶多酚对超氧阴离子的清除率随溶液质量浓度的增加而增大。超氧阴离子半抑制剂量(IC50)分别是L9型葡萄叶多酚为0.839 7 mg·mL-1;L10型葡萄叶多酚为0.849 7 mg·mL-1;茶多酚为1.014 2 mg·mL-1。由此可见,三者对超氧阴离子的清除能力与浓度之间存在量效关系,且L9与L10型葡萄叶对超氧阴离子的清除效果都优于同浓度茶多酚,L9葡萄叶多酚对超氧阴离子的清除能力是茶多酚的1.21倍,L10葡萄叶多酚对超氧阴离子的清除能力是茶多酚的1.19倍,即L9>L10>茶多酚。

图8 美洲品系葡萄叶多酚(L9、L10)对超氧阴离子的清除作用Fig.8Effect of polyphenol from American strain of grape leaves on hydroxyl radical inhibition

3 结论与讨论

通过对美洲品系葡萄叶多酚的提取工艺进行优化,得出的最佳提取条件为:乙醇浓度50%,浸提温度70℃,浸提时间60 min,料液比1∶15,多酚提取率可达1.72%。研究表明美洲品系葡萄叶多酚提取率低于其他品种,如新疆琐碎葡萄叶黄酮提取率为4.70%[13],新疆吐鲁番葡萄叶片黄酮提取率为5.33%[5],其原因可能与材料采集季节有关。在此条件下提取的美洲品系葡萄叶多酚进行抗氧化试验的结果显示:美洲品系葡萄叶多酚对DPPH自由基、羟基自由基以及超氧离子具有很高的清除能力,尤其超氧阴离子清除能力(65%)显著高于文献报道(25%)[14],其原因可能为不同品种葡萄叶中所含多酚种类与含量不同所致。结果表明,美洲品系葡萄叶多酚含量虽低于其他品种葡萄叶,但其提取物具有较强的体外抗氧化能力。研究所用材料采摘于10月,属于葡萄成熟后的废弃资源,因此可为美洲系葡萄叶的废弃资源有效利用以及以葡萄叶为原料的功能性食品、药品和化妆品的开发提供一定的科学依据。

[1]鲁玉妙,马惠玲.我国植物多酚研究文献计量及研究热点分析[J].食品科学,2012(17):290-296.

[2]马萍,郭希娟,李思荻.响应面法优化红小豆中总酚的提取[J].黑龙江八一农垦大学学报,2011,23(5):64-68.

[3]Li A N,Li S,Zhang Y J,et al.Resources and biological activities of natural polyphenols[J].Nutrients,2014,6(12):6020-6047.

[4]Khan H Y,Zubair H,Faisal M,et al.Plant polyphenol induced cell death in human cancer cells involves mobilization of intracellular copper ions and reactive oxygen species generation:a mechanism for cancer chemopreventive action[J].Mol Nutr Food Res,2014,58(3):437-446.

[5]江蓉.酯化淀粉制取工艺条件研究[J].赤峰学院学报:自然科学版,2015,31(2上):48-49.

[6]李洪飞,李文杰,孙大庆,等.微波辅助提取绿豆多酚的工艺研究[J].黑龙江八一农垦大学学报,2015,27(5):116-122.

[7]李华.现代葡萄酒工艺学[M].西安:西安人民出版社,2000.

[8]江念,陈根洪,郑小江,等.正交法优化乌蔹莓多糖提取工艺研究[J].湖北民族学院学报:自然科学版,2015(3):334-336.

[9]李凤英,崔蕊静,李春华.从葡萄叶中提取多酚物质[J].食品与发酵工业,2005,31(4):147-149.

[10]熊何健,陈益梅,吴国宏,等.葡萄籽多酚提取条件的优化[J].工艺技术,2004,25(4):115-116.

[11]徐怀德,罗安伟,师俊玲,等.天然产物提取工艺学[M].北京:中国轻工业出版社,2006.

[12]李浩,贺帮亮,洪松,等.大蒜渣中多酚物质的提取研究[J].安徽农业科学,2014,42(30):10669-10672.

[13]金鸣,蔡亚欣,李金荣,等.邻二氮菲-Fc2+氧化法检测H2O2/Fe2+产生的羟自由基[J].生物化学与生物物理学进展,1996,23(6):553-555.

[14]古丽巴哈尔·阿巴拜克力.新疆琐琐葡萄叶总黄酮提取工艺及抗氧化活性[J].食品科学,2013,34(13):104-108.

Study on the Extraction Process Optimization of Polyphenols from American Strain of Grape Leaves and its Antioxidant Activity

Luo Yinghua1,Wang Xiaowei2,Zang Yanqing2,Jin Chenghao3
(1.College of Animal Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319;2.College of Food Science,Heilongjiang Bayi Agricultural University;3.College of Life Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University)

American grape leaves were used as raw materials to study the effect of extraction solvent,temperature,time,and solid to liquid ratio on the extraction rate of polyphenols,the process conditions were optimized by orthogonal experiment,and antioxidant activities were tested as well.The results showed that the optimized extraction conditions were as follows:extraction solvent 50% ethanol,temperature 70℃,time of 60 min,solid to liquid ratio 1∶15.Under these conditions,the extraction rate of polyphenols was 1.72%.The polyphenols extraction showed strong scavenging activities on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)radical,hydroxyl redical(·OH)and superoxide redical(O2-·)methods,the scavenging rates for the radicals were 87.74%、64.92%and 65.00%(L9);86.15%、58.00%and 51.20%(L10),respectively,when the concentration was 1.0 mg·mL-1.

polyphenols;american strain of grape leaves;extraction;free redical;antioxidant activity

Q78

A

1002-2090(2016)04-0055-06

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.04.013

2015-06-10

黑龙江省留学归国人员科学基金项目(LC2015036);黑龙江省博士后科研启动资助项目(LBH-Q13132);留学人员科技活动项目择优资助;学成、引进人才科研启动计划项目(XYB2013-24);黑龙江省大学生创新创业训练计划项目(201510223003)。

罗英花(1976-),女,助理实验师,延边大学毕业,现主要从事中草药药理方面的研究工作。

金成浩,男,教授,博士研究生导师,E-mail:jinchenghao3727@qq.com。

猜你喜欢
超氧美洲茶多酚
茶多酚的抗氧化性及其在畜牧生产中的应用
两种分光光度法测定茶类产品中茶多酚含量的比较
美洲野牛当宠物
美洲动物
肠道微生物与茶及茶多酚的相互作用在调节肥胖及并发症中的作用
美洲大蠊化学成分的研究
Statistics
二氧化钛光催化产生超氧自由基的形态分布研究
荧光/化学发光探针成像检测超氧阴离子自由基的研究进展
茶多酚真能祛斑吗?