PCR技术在野生动物疫源疫病检测中的应用

王轲,王亮

(天津市滨海新区塘沽林业工作站,天津 300450)



PCR技术在野生动物疫源疫病检测中的应用

王轲,王亮

(天津市滨海新区塘沽林业工作站,天津 300450)

摘要：指出了野生动物疫源疫病检测工作在整个野生动物疫源疫病监测防控体系中占据着非常重要的作用,介绍了在疫源疫病检测中常用的PCR方法,包括普通RT-PCR、免疫PCR和实时荧光定量PCR等,以期为野生动物疫源疫病的检测提供参考。

关键词：疫源疫病;PCR;检测,实时荧光定量

1引言

野生动物疫源疫病监测防控是当前林业工作的一项重要任务,包含了监测、检测、预警和防控等一系列工作,其中检测工作在整个野生动物疫源疫病监测防控体系中发挥着非常重要的作用。野生动物疫源疫病检测分为常规检测和疫情检测,常规检测主要是在野生动物疫源疫病流行高峰期,对救治的野生动物和随机捕捉的野生动物进行粪便、血液和羽毛采样并检测;疫情检测是对死亡的野生动物进行采样检测,分析确定是否发生疫情。

野生动物疫病种类繁多,危害性大,在野生动物种群之间传播速度快,且易传染给人类,威胁社会公众卫生安全。如高致病性禽流感是危害野生候鸟最常见的高度接触性、急性传染病,近几年我国出现多次人感染高致病性禽流感的案例,严重威胁社会安全。因此,完善野生动物疫源疫病监测防控体系,建立野生动物疫源疫病检测专业实验室,提高检测水平,对于保护野生动物资源和社会生态安全有着非常重要的作用。PCR技术是一种基于DNA变性与复性原理,高效扩增体外特定DNA片段的技术[1],这种技术具有快速高效、操作简便、灵敏度高、特异性强、批量检测和痕量检测等特征,目前被应用于生物学基因鉴定、实验和疫源疫病检测等领域。常规PCR是所有由PCR技术衍生出来的检测方法的技术,在野生动物疫源疫病检测中常用的有普通RT-PCR技术、免疫PCR和实时荧光定量PCR技术等。

2普通RT-PCR

反转录PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)技术是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增相结合,被广泛应用于基因诊断、病原微生物检测等,相比传统病毒分离鉴定试验灵敏度高,特异性强,周期短,可以为病毒的早期诊断提供快速、准确的方法。普通PCR技术已经无法满足多病原体的快速鉴别诊断,因此在常规RT-PCR基础上发展起来双重和多重RT-PCR技术,这种技术能在单个反应体系中同时检测多重病毒[6],具有高特异性、高效率、低成本等特点,适合大量样本的检测。

制定林业经营方案必须要对资源蓄积消长情况作时间性分析比对。这些资源在每个时间段端点蓄积情况的精准数据就来源于林业档案记载。由此看来,林业档案所反映的情况,必须要真实、可靠,既是对现实经营提供科学的依据,更是为备考的历史资料作保存。做好林业档案工作是对历史真实性的负责。

3.4为制定区域性林业发展、环境保护等战略性规划提供依据

随着计算机大数据库的发展,林业档案资料实施电子化管理,建立网络化资源共享平台,让人类社会对林业事业的发展有着共同的认识,让林业档案中的林业文化事业为社会经济繁荣发展作出重大贡献。

4结语

(1)林业档案是林业单位或管理部门不可缺少的宝贵财富资源和有价值的、历史的文化遗产,其价值不可估量。每个林业单位或管理部门都要投入必要的人力、物力、财力去完成。林业档案工作必须要具有专业性、事业性强的人员才能胜任。

(2)林业档案建设的目的在于其价值的利用。如何建立计算机大数据库,建设网络化平台,还有待于我们去进一步研究。

参考文献：

[1] 李瑞平,王洪静,罗文娟,等.林业档案管理工作存在的问题及对策分析[J].河北林果研究,2013(1):95～97.

[2] 罗宁.档案信息资源开发利用工作浅析[J].黑龙江档案,2010(2):102.

[3] 王晶,李晓华.谈如何提高档案管理工作水平[J].科技创新与应用,2012(7):56～58.

[4] 薛涛.林业科技档案的管理和开发利用[J].中国科技信息,2007(11):34.

周建红[5]等应用普通RT-PCR技术对40分禽类样品进行H5亚型禽流感病毒检测,实验结果表明该方法可基本满足当前的检测需要。张应国[4]等利用多重RT-PCR技术在3～4 h内,完成对36株禽流感及其他病毒分离物检测,结果显示该方法可以快速、特异和敏感的鉴别和监测A型及H9N2、H5N1亚型禽流感病毒。刘婧君[7]分别用单-RT-PCR和双重RT-PCR技术对样品中的禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒进行检测,研究表明尽管该双重RT-PCR方法比单～的RT-PCR检测方法的敏感性下降了10倍,但建立的双重RT-PCR技术仍具有极高的敏感性,特异性和快捷性,具有很高的实用价值。在H3N2亚型禽流感病毒检测研究方面,刘婷婷[9]通过设计筛选2对引物和优化反应条件,建立了一种双重RT-PCR方法,能够有效检测临床样品。

3免疫PCR

免疫PCR (I mmuno polymerase chain reaction)技术是一种检测微量蛋白的高灵敏度技术,它将抗原抗体反应的特异性和PCR反应的敏感性有机结合起来,能够检出浓度低至2 ng/L的抗原物质,能够有效解决普通RT-PCR方法存在的不足和弊端,在医学和生物技术领域的使用研究取得了很好的效果。目前免疫PCR技术已经开发出不同的种类,包括定量免疫PCR、双相免疫PCR、磁性免疫PCR、免疫捕捉PCR、双抗体夹心免疫PCR等。

目前尽管免疫PCR技术灵敏度非常高,正是由于其高敏感性和操作步骤的复杂性,使得免疫PCR技术在操作过程中容易受到交叉污染,影响检测结果,因此如何简化步骤以实现标准化的快速检测就成为免疫PCR 发展的重要探索方向[10]。邓明俊[8]建立了4种免疫PCR检测技术,分别以H5亚型禽流感病毒和H5亚型血凝素蛋白为对象进行检测,研究结果显示它可以对活H5N1和H5亚型血凝素蛋白直接、大批量的检测。

4实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR技术(real- time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,real-time FQ～PCR)是分子生物学研究的重要工具,具有操作简便、快速高效、高敏感性、特异性、可重复性和定量浓度范围大等优点,且具有定量分析、定性分析以及多重扩增等功能,灵敏度要高于常规的PCR技术,目前被广泛运用于新型农业、分子诊断、动植物检疫、国防军事和食品安全检测等领域。

传统的野生动物疫源疫病检测方法依赖于症状观察、病毒培养或菌落培养等技术,近年来实时荧光定量PCR凭借其独特的优越性,被广泛应用于禽流感等病毒的检测。如刘婷婷[2]等通过设计筛选TapMan探针和引物,优化引物和探针的配比浓度,建立了一种可以同时检测H3和H4亚型禽流感病毒的双重实时荧光定量RT-PCR方法,能够快速有效检测H3和H4亚型禽流感病毒的病原含量。罗宝正[3]等为快速高效检测H7N9亚型禽流感病毒,建立了多重荧光RT-PCR方法,该方法通过设计两套特异性的引物和探针,能够快速、痕量、精确的检测H7N9亚型禽流感病毒,既不会对H7造成漏检,也可以检测判断是否为新型N9亚型病毒。谢芝勋等建立二重荧光定量RT-PCR方法,设计了禽流感和新城疫病毒的检测方法。

5结语

目前实时荧光定量PCR技术凭借其快速、高灵敏度、高特异性、定性分析和定量分析等优势,在禽流感病毒和新城疫病毒的检测方面被广泛应用,为我国野生动物疫源疫病检测争取了宝贵的快速反应时间,采取必要措施切断疫病的传播,防治交叉感染,对保护野生动物资源有着重要的意义。

[1] 胡贞.PCR技术及其在禽流感诊断中的应用[J].中国畜牧兽医文摘,2015,31(8):64,16.

[2] 刘婷婷,谢芝勋,宋德贵,等.H3和H4亚型禽流感病毒双重实时荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国家禽,2015,37(7):20～24.

[3] 罗宝正,莫秋华,李儒曙,等.新型H7N9亚型禽流感病毒多重荧光RT-PCR快速检测方法的建立[J].病毒学报,2014,30(1):1～5.

[4] 张应国,宋建领,胡媛媛,等.禽流感病毒RT-PCR及多重RT-PCR检测技术的建立[J].中国兽医科技,2005,35(8):600～604.

[5] 周建红,梅小伟,马涛,等.RT-PCR技术在诊断H5亚型禽流感病毒中的应用[J].湖北畜牧兽医,2015,36(7):11～12.

[6] 陈明洁,方倜,柯涛,等.多重PCR一种高效快速的分子生物学技术[J].武汉理工大学学报,2005,27(10):33～36.

[7] 刘婧君.野鸭禽流感病毒和新城疫病毒双重RT-PCR检测及禽流感病毒的部分序列分析[D].南京:南京农业大学,2008.

[8] 邓明俊.免疫PCR检测低含量H5N1禽流感病毒方法的建立及初步应用[D].杨凌:西北农林科技大学,2010.

[9] 刘婷婷,谢芝勋,宋德贵,等.H3N2 亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立[J].兽医科学,2015(7):172～174.

[10] 黄明,肖笑,徐晟,等.免疫PCR 检测技术及其在食品安全领域中的应用[J].南京农业大学学报,2010,33 (6):119～124.

中图分类号：S853

文献标识码：A

文章编号：1674-9944(2016)01-0065-02

作者简介：王轲(1989—)，男，山东聊城人,助理农艺师,主要从事野生动物保护工作。

收稿日期：2015-11-19