犬细小病毒的分离鉴定

姚 红 （山东省东平县畜牧兽医局 271500）

犬细小病毒的分离鉴定

姚 红 （山东省东平县畜牧兽医局 271500）

犬细小病毒(canine parvovirus, CPV)属于自主复制性细小病毒科，细小病毒属，它能引起急性肠炎，白细胞减少，呕吐以及幼犬的心肌炎等病症。为了更好的了解犬细小病毒病在我国的流行和变异情况，通过对宠物医院疑似犬细小病毒病例进行病毒分离，分离出一株犬细小病毒，经过形态学、生物学以子病毒学等鉴定，证明分离出的毒株为细小病毒。

1 犬细小病毒病原生物学

犬细小病毒(canine parvovirus, CPV)是细小病毒科，细小病毒亚科，细小病毒属的成员，具有细小病毒属的典型形态和结构。

1.1 形态特点与理化性质

CPV的病毒粒子为等轴对称的二十面体，无囊膜，抗氯仿，耐酸耐热。在电镜下观察病毒颗粒的外观呈圆形或六边形，直径为20～24nm[1]。

1.2 血凝特性

CPV具有血凝特性，能凝集猪及恒河猴的红细胞(本试验用的是猪的红细胞)，这一特性可作为病毒特性的参考指标。

1.3 病毒培养特性

小病毒的DNA复制发生在细胞核内，其复制过程出现于细胞周期的S期。这是因为细小病毒DNA复制完全依赖于宿主DNA聚合酶及其复制体系。如果利用DNA聚合酶抑制剂处理宿主细胞，细小病毒DNA在宿主细胞内完全不能进行复制。所以当体外进行该病毒培养传代时，不能像一般常规实验那样等到细胞长成单层后才接毒，而必须在细胞培养的同时或最迟在24h内接种病毒，这样才能达到使病毒增殖的目的。

1.4 犬细小病毒衣壳蛋白

据文献[3]报道CPV衣壳蛋白是由VP1和VP2构成，VP3是VP2的裂解物，它只在衣壳装配和病毒基因组包装后才出现，其相对量随着感染进程和发展而增加。CPV粒子表面由60个机构亚单位装配而成，其中VP2占到54～55个，而VP1只占到5～6个[4]，因此VP2是构成衣壳蛋白的主要成分，同时细小病毒的主要抗原位点也在VP2蛋白上，因此VP2上的几个碱基和氨基酸的改变就会影响抗原特征和宿主范围，CPV以及CPV不同病毒型间存在差异[5]。

2 犬细小病毒的分离与鉴定

2.1 犬细小病毒的分离

本试验通过猫胎肾细胞(F81)增殖犬细小病毒，同时采用同步接毒的方法使病毒增殖，最后收获病毒，进行鉴定试验。

2.1.1 试验试剂及仪器 （1）病料：在周边宠物医院采集临床表现有体温升高、呕吐、血样腹泻、脱水等症状的疑似犬细小病毒的病例中，采集粪样。（2）细胞株：猫胎肾细胞(F81) （3）主要试剂：胰蛋白酶，，胎牛血清(FCS)。（4）主要器材70P-72型超速离心机，购自日本HITACHI公司；DW-40L262型立式医用冰箱，购自中国海尔公司。（5）各种溶液的配制：①DMEM 营养液的配制：取DMEM粉剂一袋(13.5)，再用电子天平称取碳酸氢钠1.5g，放入1500ml的圆底烧瓶中，缓缓加入三馏水定容至1L，混匀后用10mol/L的氢氧化钠调pH值到7.2～7.4，用0.22µm的一次性滤器过滤除菌后，再分别加入2%和10%的胎牛血清，放入4℃冰箱中保存待用。②D-Hanks液的配制：用电子天平分别称取氯化钠0.40g、磷酸二氢钾0.06g、氯化钠8.00g、碳酸氢钠0.35g、磷酸氢二钠0.09g、酚红0.01g加入1500ml的圆底烧瓶中，缓缓加入三馏水定容1L，全部混匀后用1mol/L的氢氧化钠或者1mol/L的盐酸调pH为7.2，然后智能压力蒸汽灭菌器121℃高压灭菌20min，至4℃冰箱内储存。②0.25%的胰酶的配制：用电子天平分别称取胰蛋白酶(1∶250)1.25g、EDTA二钠0.514g、葡萄糖2.5g加入容量瓶中，缓缓加入D-Hanks液定容至500ml，然后用 一次性滤器滤过，在分装到青霉素瓶中，用封口条封好后放入-20℃的冰箱中储存。②PBS 液的配制∶用电子天平分别称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.15g、磷酸二氢钾0.2g放入容量瓶中，加入100mol/L的EDTA20ml，然后用蒸馏水稀释至1000ml。

2.1.2 细胞培养与病毒增殖 （1）病毒的粗提：取宠物医院采集的粪便用Hanks液配制成1∶10的乳剂，离心10min，取上清，经0.22μm微孔滤膜无菌滤过后准备接种。（2）细胞复苏：把细胞冻存管从液氮中迅速取出，立即放入40℃水浴中，边浸边摇动，使细胞冻存液尽快融化，用75%的酒精棉擦拭冻存管，打开管盖，吸出细胞悬液，然后800rpm/min离心5min，吸弃冻存液，准备进行细胞培养。（3）细胞培养：复苏的细胞接入100ml的细胞瓶内并加入细胞培养液进行培养，把细胞瓶置于培养箱中(37℃，5%CO2)培养，第2天观察细胞的生长状态，待到细胞基本长满单层时进行传代，具体方法是倾弃细胞旧液，用Hanks液洗涤2～3次，之后加入0.25%的胰酶(以浸没细胞单层为佳)进行消化，待细胞将要分离而呈圆粒时，加入细胞维持液终止消化，用刻度吸管反复吹打细胞，直至完全分散，重新悬浮细胞，按一传而接入新的细胞瓶中，置于培养箱中(37℃，5%CO2)培养。（4）病毒的增殖与提纯∶采用同步接毒的方法，取长满单层的细胞在细胞传代的同时将带接种的样品按19接种细胞培养液，置于培养箱中培养(37℃，5%CO2)24h后再换维持液，继续培养，并设正常细胞作对照。每天在电镜下观察接毒后的细胞形态，并更换维持液，5d左右把细胞瓶中出现细胞病变的经-20～37℃反复冻融3次后收毒，用此方法反复增殖病毒，用于提纯病毒，提出的病毒置于-20℃备用。

2.1.3 结果 正常的F81细胞贴壁生长，细胞之间连接紧密并且均质透明，呈现不规则的多边形，犬细小病毒(CPV)感染猫胎肾细胞(F81)后一般在盲传3～5代时出现明显的脱落、变形、游离、拉网等细胞病变(CPE)。

2.1.4 讨论 CPV主要侵害动物黏膜上皮细胞，因此分离病料时选择动物的肠道内容物，肠黏膜上皮细胞，用F81细胞增殖CPV出现了明显的细胞病变，这与前任的研究结果相符合。由于CPV的DNA在复制时需要处于有丝分裂过程中宿主细胞某些机能的辅助，CPV分离培养不同于一般病毒分离，主要是病毒本身所带的基因有限，需要宿主细胞帮助其复制病毒增殖钱所用的各种酶，这就要求宿主细胞必须处在细胞分裂的S期，故培养病毒是一般采用同步接毒的方法，这样能达到使病毒良好增殖的目的。

2.2 犬细小病毒的鉴定

分离出的病毒通过免疫电镜观察到大小均一，直径在20～24nm，外观为圆形的病毒粒子，从而可从形态学上对细小病毒作以鉴定；而通过血凝试验（HA）能凝集猪的红细胞，凝集效价达1×109并且能被细小病毒的阳性血清有规律的抑制，结果与其生物学特性符合；通过PCR的扩增结果可以从分子生物学上对此病毒进行鉴定。

2.2.1 试验试剂与仪器 （1）主要试剂：健康猪的经脉血液，采自附近猪场；葡萄糖，氯化钠，枸橼酸钠，枸橼酸。（2）主要仪器：各型微量可调移液器，生物显微镜，；96孔培养板，WZ-2A微量振荡器， DK-8D型电热恒温箱。（3）猪红细胞悬液的制备：先于25ml注射器内吸入阿氏液母液(萄糖2.059g、枸橼酸钠0.89g、枸橼酸0.0559g、氯化钠0.426g，加入蒸馏水溶解至1000ml，用115℃高压灭菌20min，4℃存放)3～5ml，于健康猪耳缘静脉或颈静脉采血10～20ml，立即混匀，放4℃可存放7～10d。使用时，先用生理盐水将保存的猪红细胞离心沉淀3次，最后1次以3000r/min离心10min，弃上清，取次红细胞1ml，加稀释液100ml，再加入牛血清蛋白0.1g，即为1%的猪红细胞悬液。

2.2.2 试验方法 （1）细菌学鉴定：将同步接毒的细胞做成切片，在显微镜下进行观察。（2）电镜观察：取代鉴定病毒培养物，用0.5%磷酸钨溶液进行负染后，用电镜观察。（3）血凝试验：犬细小病毒在一定条件下能凝集猪的红细胞，可作为犬细小病毒初步鉴定的依据[5]。采用微量法在96孔V型板上进行，每排的第1孔至第12孔加入50μl生理盐水，吸取纯化的病毒抗原液50μl加入第1个孔，混匀后加入第2个孔，倍比稀释11孔，从该孔弃去50μl，第12孔不加抗原作为阴性对照，最后每孔加入50μl1%的猪红细胞悬液，震荡混匀，做3个平行，重复2次。将V型板置于4℃冰箱中，一般作用30min，待红细胞对照完全沉淀后读取试验结果。（4）分离毒的PCR扩增：①模板病毒的DNA抽提：用“小组织/细胞基因DNA抽提试剂”进行抽提，制作模板DNA。PCR②扩增：PCR反应体系：10×buffer5μl、MgCL25μl、dNTP4μl、上游引物1μl、下游引物1μl、Taq酶0.5μl、无菌蒸馏水31.5μl，总体积为50μl。用石蜡油覆盖后进行PCR扩增。PCR反应条件∶96℃ 3min、96℃ 30s、52℃ 30s、72℃ 60s、30个循环；最后再72℃延伸10min。取10μl PCR产物加1μl电泳上样缓冲液上样，以70～80V/cm进行琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下观察结果。

2.2.3 结果 （1）电镜形态学观察结果：用病毒分离培养物的上清液作为电镜负染观察，结果可见有呈二十面体立体对称大小约为20～24nm的病毒粒子出现。（2）血凝试验结果：结果判定：“#”表示100%红细胞被凝集“+++”表示75%红细胞被凝集，“++”表示50%红细胞被凝集，“+”表示25%红细胞 被凝集。其血凝效价以能凝集100%红细胞病毒的最高稀释倍数表示。结果见附表。

附表 CPV对猪红细胞血凝试验(HA)结果

（3）PCR检测结果：用两对引物对分离的细小病毒毒株进行PCR扩增，P1和P2扩增得到846bp的片段，P3和P4扩增得到815bp的片段。

2.2.4 讨论 HA的检测结果与犬细小病毒的特性相符，能在4℃的条件下凝集猪的红细胞，并且能被CPV阳性血清有规律的抑制。研究发现HA的凝集效价受PH值的影响，在pH为6.4～7.2之间较稳定，并且在PH＜6.4的时候猪的红细胞会发生自凝。每个样品做3个平行2次重复，结果的重复性很好，说明该方法在实际的应用中能经济、简单、快捷、可靠的对CPV作出鉴定。在电镜下观察，可见大小均一、成聚集状态的病毒粒子。病毒粒子有电子密度相差悬殊的空心和实心两种形态存在，多为圆形，五囊膜，直径在20～24nm。从而可从形态学上对CPV作以鉴定。

3 结论

通过同步接毒的方法经猫胎肾细胞(F81)可增殖细小病毒。成功利用血凝试验HA电镜观察、PCR扩增的方法对分离的毒株进行鉴定，为我国犬细小病毒病的流行病学提供了一定的参考资料。

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