细胞工厂培养禽流感（H9亚型）病毒试验研究

高英

（辽宁省北镇市动物疫病预防控制中心，辽宁 北镇 121300）

细胞工厂培养禽流感（H9亚型）病毒试验研究

高英

（辽宁省北镇市动物疫病预防控制中心，辽宁 北镇 121300）

禽流行性感冒（简称禽流感，Avain Influenza，AI）是由A型流感病毒引起的一种禽类（包括家禽和野禽）的感染和或疾病综合征，主要引起禽类的全身性或呼吸系统性疾病，被世界动物卫生组织确立为A类传染病。对各国养禽业危害很大。

我国通常用鸡胚培养禽流感病毒（AIV）来生产AI疫苗，由于鸡胚培养病毒存在诸多缺点，我们进行了用细胞培养（AIV）的试验研究，主要用转瓶培养细胞、细胞工厂培养细胞来增殖培养（AIV）对比试验和细胞工厂培养（AIV）的工艺优化试验，取得了很好的效果。

1 材料与方法

1.1 毒 株

H9N2亚型禽流感病毒，由本单位分离并鉴定。

1.2 主要试剂

DMEM培养基购自Gibco公司，进口胎牛血清由购自Hyclone，胰酶购自Washington公司，Nunc EasyFill细胞工厂（10层，培养面积6320cm2，工作容量2000mL）购自Thermo Fisher。

1.3 细胞及传代培养

细胞：MDCK细胞来自哈尔滨兽医研究所，在本实验室已扩增冻存，目前在本实验室传至75代，已经适应在本实验室的培养基中生长。

细胞传代的方法：首先复苏所选择的种细胞MDCK到T75的细胞瓶中，生长48h左右，按照1:4的比例进行传代；然后把6个长满细胞的T75细胞瓶中的细胞传到1个10L转瓶进行培养；48h左右按照1:3的比例进行细胞传代培养；该过程中使用的培养基为DMEM，血清为胎牛血清，使用量为10%。

收获转瓶中的细胞：将转瓶中所得细胞用PBS洗涤2次，然后加入浓度为0.25%胰酶-EDTA溶液125mL消化，收集细胞。

收获得细胞经计数后，采用Thermo Scientific Nunc细胞工厂（10层，培养面积6320cm2，工作容量2000mL)对MDCK细胞进行培养；所用的培养基是DMEM培养基。所用其它试剂包括牛血清、TPCK-胰酶等。细胞接种后在12h、24h、48h取样观察细胞在细胞工厂上的生长状况。

1.4 AIV在细胞工厂中增殖的条件优化

为了阐明细胞密度、病毒感染复数（MOI）和BSA浓度对AIV病毒增殖的影响，采用多因素实验设计方法，考虑 MOI （0.1、1）、细胞密度（0.5×105细胞/mL，1.0×105细胞/mL）和BSA浓度（0.5%、1%）3个水平试验因素，在各水平条件下以组织培养半数感染量（TCID50）和血凝价（HA）作为观测指标，确认AIV病毒滴度在不同增殖条件下的差异。

1.5 收 获

培养至80%以上的细胞出现致细胞病变效应（CPE）时，收获。

2 试验结果

2.1 细胞工厂与转瓶培养细胞面积比较结果

表1 细胞工厂与转瓶培养面积比较

2.2 AIV在细胞工厂中增殖条件优化结果

通过表2可以看出病毒繁殖效果最差的是4组，在该条件下最大的HA为128，而在1组合2组中，病毒HA最大达到了1024，效果相同，其中2组TCID50优于1组，达到了4.78×107TCID50/mL。

因此，病毒繁殖的条件为：细胞密度优选5～10万细胞/mL，H9N2亚型AIV种毒按MOI=1进行接种，病毒维持液为不含血清的DMEM（1%BSA和2μg/mL的TPCK-胰酶），放入38℃温室培养48～72h。

3 小结

通过试验研究结果表明，利用细胞工厂培养的H9亚型（AIV）具有较高的免疫原性，批量生产大，降低生产成本，适合大规模培养来生产AI疫苗。

表2 AIV在细胞工厂中增殖条件优化结果

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．03.017