呼伦贝尔犊牛免疫前后口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白检测结果对比分析

王冠玉，冯 岩，王景春，王 巍，格根塔娜，苏日古格，田宗民，余兴邦

（1.内蒙古呼伦贝尔市动物疫病预防控制中心，内蒙古 呼伦贝尔 021008；2.海拉尔区动物疫病预防控制中心，海拉尔 内蒙古 021008；3.莫力达瓦达斡尔族自治旗动物疫病预防控制中心，内蒙古 莫力达瓦 162850）

呼伦贝尔犊牛免疫前后口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白检测结果对比分析

王冠玉1，冯 岩2，王景春3，王 巍1，格根塔娜1，苏日古格1，田宗民1，余兴邦1

（1.内蒙古呼伦贝尔市动物疫病预防控制中心，内蒙古 呼伦贝尔 021008；
2.海拉尔区动物疫病预防控制中心，海拉尔 内蒙古 021008；
3.莫力达瓦达斡尔族自治旗动物疫病预防控制中心，内蒙古 莫力达瓦 162850）

口蹄疫（foot and mouth disease，FMD）是一种高度接触性病毒传染病，传播速度快，发病率高，可对养殖业造成巨大的经济损失。世界动物卫生组织（OIE）将其列入A类动物传染病之列，我国农业部将其作为一类动物疫病中的重点重大动物疫病。目前，我国口蹄疫的主要防治措施依然是以灭活疫苗免疫为主，如何有效区分感染抗体与免疫抗体一直以来都是口蹄疫防控工作中亟待解决的重要难题。3ABC是口蹄疫病毒的一种非结构蛋白，它参与口蹄疫病毒RNA复制过程，是口蹄疫病毒一个高度保守区域。利用原核和真核系统表达的3ABC蛋白能与全部7个血清型的口蹄疫病毒感染血清发生免疫反应，是鉴别免疫动物和感染动物的理想抗原之一。通过ELISA方法检测口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白，是国内各地动物防疫机构鉴别口蹄疫病毒感染抗体与疫苗免疫抗体的最常用手段，对指导口蹄疫防控工作具有至关重要的作用。

本文通过使用两种诊断试剂按不同比例稀释被检样品，对比实验犊牛免疫前后口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白的检测结果，发现实验结果存在明显变化。并分析结果总结规律，针对可能存在的影响因素，提出改进建议。

1 材料与方法

1.1 诊断试剂与疫苗

北京某品牌口蹄疫病毒非结构蛋白抗体单抗阻断ELISA试剂盒（FMDV20151020E）；甘肃某品牌口蹄疫病毒3ABC单抗阻断ELISA抗体检测试剂盒（20151113129）；北京某品牌口蹄疫病毒通用型RT-PCR检测试剂盒（FMD20151202P）；甘肃某品牌口蹄疫三价灭活疫苗。

1.2 实验动物

不同月龄、不同饲养环境下的临床健康犊牛30头，来源于免疫背景清晰、生产记录详细的规模化养牛场。

1.3 实验设计

对30头犊牛于初免前、免疫口蹄疫三价灭活苗后1个月共2次分别采集一一对应的血清及O-P液样品，进行口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白检测和分子生物学RP-PCR检测。在进行3ABC非结构蛋白检测时，采用4种实验方案进行检测：（方案1）是将90份血清样品，按总体积比1：2比例进行稀释，用北京品牌试剂盒进行检测；（方案2）按照1：5比例稀释，用北京品牌试剂盒进行检测；（方案3）按照1：2比例稀释，用甘肃品牌试剂盒进行检测；（方案4）按照1：5比例稀释，用甘肃品牌试剂盒进行检测。

2 实验结果

2.1 口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白检测结果

免疫前采集的血清样品进行口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白检测后，在 1：2比例稀释下，北京品牌的诊断试剂共检出阳性样品5份，疑似样品23份，阴性样品2份；其余方案检测结果均为阴性。免疫后再进行采样时，有5头犊牛不知去向无法采集样品，所以没有检测结果。其余样品，在1：2比例稀释下，北京品牌的诊断试剂共检出阳性样品4份，疑似样品21份，阴性样品0份；在1：2比例稀释下，甘肃品牌的诊断试剂检出阳性样品1份，疑似0份，阴性24份；其余方案检测结果均为阴性。（见表1）

表1 口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白检测结果

2.2 口蹄疫病毒RT-PCR检测结果

经检测，全部O-P液样品均为阴性，未发现口蹄疫病毒。

3 讨论与分析

3.1 血清样品的稀释程度对结果影响显著

通过对比4种方案的检测结果可以看出，原本1：2稀释比例下的阳性、疑似样品，略微增加稀释倍数后，结果全部呈阴性。

3.2 口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白抗体水平经疫苗免疫后呈上升趋势

通过对比北京品牌诊断试剂1：2稀释比例下，免疫前后两次的检测结果可以发现，免疫后口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白检测结果下降的样品有2份（阳性转为疑似），口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白检测结果上升的样品5份（阴性转疑似2份，疑似转阳性3份）。其中，001001号样品在甘肃品牌诊断试剂检测结果中，也由阴性转为阳性。综合对比可见，口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白抗体水平经疫苗免疫后呈明显上升趋势。

3.3 不同诊断试剂敏感程度不同

本次实验中，北京品牌的诊断试剂敏感度较高，按说明书中要求的样品稀释比例为1：2，甘肃品牌的诊断试剂说明书中要求的样品稀释比例为1：5，全部样品均按照各自诊断试剂说明书中要求的稀释比例进行检测，结果显示北京品牌检出大量非结构蛋白阳性、疑似样品与而甘肃品牌检测结果全部呈阴性。按照有关规定，本次实验中，北京品牌诊断试剂检测出的阳性样品和连续2次检测呈疑似的样品，均应判定为口蹄疫感染抗体阳性样品。则全部30头犊牛中，至少23头应怀疑曾感染过口蹄疫病毒。但全部实验动物临床健康，没有1头发病，再用同种检测方法少量增加样品稀释倍数后，检测结果转为阴性，且RT-PCR实验中未检出口蹄疫病毒阳性样品，说明其他一些因素可能影响了北京品牌检测试剂的检测结果。赵丽霞、关平原、陈君彦等人的研究表明，国内某些疫苗在生产过程中，因生产工艺限制，疫苗纯化程度不高，在口蹄疫疫苗中会存在含有痕迹量的3A、3B、2B、2C、3ABC等非结构蛋白。在重复多次免疫，特别是加大免疫剂量之后，痕迹量的非结构蛋白也可能刺激机体产生抗体，并被一些口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白检测试剂检测出来，而出现“假阳性”结果。

4 问题与建议

4.1 感染口蹄疫病毒后，机体产生的3ABC抗体效价应该是较高的，应进一步开展相关研究实验，确定最低感染量时机体内3ABC抗体效价，从而通过统一标准的样品稀释比例，屏蔽疫苗中痕迹量非结构蛋白的影响，真实反映口蹄疫病毒感染抗体检测情况。

4.2 本实验中，未免疫犊牛在检测中出现的“假阳性”来源未查清，可能来自母畜的母源抗体，也可能来自于自然环境中的口蹄疫病毒的微量感染，需进一步实验研究进行确认。

4.3 在实际工作中，如果遇到口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白检测结果异常偏高，应尽量多对比其他检测方法的检测结果，并结合大量的流行病学调查数据和病原学检测结果进行综合分析和评价，为口蹄疫防控工作提供科学可靠的依据，避免造成不必要的人力物力资源浪费。

[1]谢庆阁.口蹄疫[M].北京:中国农业出版社，2004.9-12.

[2]王宏伟，等.口蹄疫病毒3ABC、3AB、3BC基因克隆、表达及其抗体消长规律的研究[J].中国农业科学，2004，37（7）：1065-1070.

[3]赵丽霞，等.通过检测非结构蛋白抗体评价口蹄疫疫苗纯度的研究[J].中国兽医杂志，2015，49（4）：17-20.

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．03.016