猪流行性腹泻病毒繁殖条件的研究

王靓靓，白会新

(1.大庆市动物卫生监督所，黑龙江 大庆 163311；大庆市畜牧技术推广站，黑龙江 大庆 163311)

猪流行性腹泻病毒繁殖条件的研究

王靓靓1，白会新2*

(1.大庆市动物卫生监督所，黑龙江 大庆 163311；大庆市畜牧技术推广站，黑龙江 大庆 163311)

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV) 引起的一种严重的病毒性传染病。该病可导致哺乳仔猪发生严重的腹泻、呕吐、脱水，并且致死率极高，给养猪业带来了巨大的危害。实验为了提高PEDV的繁殖滴度，对PEDV的培养条件进行优化并连续体外传代培养，分别从改变胰酶浓度、吸附时间和培养方式三个方面进行了PEDV的传代培养，最终提高了病毒的滴度（TCID50），从而降低了该病毒的致病性。

猪流行性腹泻病毒；疫苗；培养特性

PEDV是一种有包膜的单链RNA病毒，属于冠状病毒科，冠状病毒属，该病毒引起的临床症状一般表现为严重的水样腹泻，病猪在腹泻3～4 d后，会因严重脱水而死亡。PEDV经口传染仔猪，在腹泻的早期阶段，它富集在小肠内的组织内容物中。随着PEDV在许多国家的暴发，国内外很多学者始终致力于研究PEDV的培养条件［1］，提高病毒的滴度［2］，为PEDV的疫苗研制提供重要的物质基础。但是，由于其复杂的培养条件，病毒在细胞中繁殖滴度等问题仍是急需解决的难题之一。为了解决此问题，本实验通过改变胰酶浓度、吸附时间和培养条件等方面对PEDV HLJBX株进行培养，确立了PEDV的最佳培养条件，从而提高了病毒的滴度，为下一步疫苗开发奠定了一定的基础。

1  毒株、细胞系和引物

本实验在东北农业大学动物医学院预防与兽医学实验室进行，PEDV HLJBX株由实验室分离并保存，非洲绿猴传代肾细胞（Vero）细胞系于实验室保存， PEDV鉴定引物均由实验室设计并由博仕生物公司合成。

2  实验方法

2.1  细胞库的建立

将Vero细胞的复苏后，进行培养，待细胞库性状稳定后进行无菌检测和支原体检测。

2.2  PEDV的特异性检测

2.2.1 间接免疫荧光检测

接种病毒的Vero细胞培养48 h后弃培养液，用PBS漂洗细胞标本片3次，用4%多聚甲醛溶液固定细胞，室温20 min后用PBS漂洗3次，用甘氨酸溶液350μL/孔处理细胞，室温10 min，再用PBS漂洗3次，将残留液弃净后，加入一抗，37 ℃孵育60 min，PBS洗涤3次后，再加二抗，37 ℃避光孵育60 min，最后用中性甘油封片，于荧光显微镜下观察并拍照。

2.2.2 RT-PCR检测

取150μL的PEDV放入EP管中，管中加入RA2液500μL，充分颠倒10次，静置1 min。将PEDV裂解物全部吸入内套管中，离心1 min。取出内套管，弃掉外套管中的液体，在内套管中加入500 μL洗液，离心1 min。重复一次上面的步骤后，取出内套管弃掉外套管中的液体，再将内套管放回到外套管中，不加洗液离心1 min。将内套管移入新的EP管中，在内套管膜的中央加入洗脱液25 μL，室温静置1 min后离心1 min，获得总RNA。之后用PEDV引物将RNA反转录成cDNA，反应参数为42 ℃、1 h，72 ℃、15 min，冰上冷却。

将反转录的产物使用上游引物及下游引物进行PCR扩增。反应条件为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，30个循环；72 ℃终延伸10 min。

反应结束后，用1 %琼脂糖凝胶电泳检测结果。

2.2.3 PEDV滴度的测定采用96孔板进行测定。首先将细胞进行消化，分装到96孔板内，待细胞长满80 %时，弃去DMEM液，用PBS洗3次，将病毒稀释成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，

10-9，10-10，10个稀释度，每一稀释度接种5孔细胞，接种量为100 μL/孔，并设立一行作为细胞对照，在接毒后72 h，判定细胞病变，当病变细胞在80 %以上时，判定为病变细胞孔，进行TCID50的测定。按公式计算（Reed-Muech 氏法）。

2.2.4 PEDV滴度的提高

2.2.4.1 不同胰酶浓度对病毒滴度的影响

取生长良好的Vero单层细胞进行消化，分装到24孔板中，观察细胞，待细胞长满80%时，弃去24孔板中的培养液，用PBS清洗细胞2次，将病毒液和无血清的DMEM液混合，同时胰酶终浓度分别为1 μg/mL、2.5 μg/ mL、5 μg/ mL、10 μg/ mL、15 μg/ mL、20 μg/ mL、25 μg/mL、50 μg/ mL、60 μg/ mL和75 μg/ mL，在37 ℃培养箱内共同吸附1 h后加入不含血清的DMEM，同时设立细胞对照孔，37 ℃培养，72 h收毒，繁殖8代后，均接种在长满Vero细胞的96孔板中进行TCID50测定。

2.2.4.2 不同吸附时间对病毒滴度的影响

取生长良好的Vero单层细胞进行消化，分装到24孔板中，观察细胞，待细胞长满80 %时，弃去24孔板中的培养液，用PBS清洗细胞2次，将病毒液、最适的胰酶终浓度和无血清的DMEM液按比例混合，在37 ℃培养箱内共同吸附0.5 h、1 h、1.5 h和2 h后加入不含血清的DMEM，同时设立细胞对照孔，37 ℃培养，72 h收毒，繁殖8代后，均接种在长满Vero细胞的96孔板中进行 TCID50测定。

2.2.4.3 不同培养条件对病毒滴度的影响

取生长良好的Vero单层细胞进行消化，分装到24孔板中，观察细胞，待长满80 %时，弃去24孔板中的培养液，用PBS清洗细胞2次，将病毒液、最适的胰酶终浓度和无血清的DMEM液按比例混合，接种在Vero细胞上，在到达最适吸附时间时，一孔直接加入无血清的DMEM，一孔弃去吸附液后加入无血清的DMEM，并设立细胞对照孔，37 ℃培养，72 h收毒，繁殖8代后，均接种在长满Vero细胞的96孔板中进行 TCID50测定。

3  实验结果

3.1  Vero细胞的培养

待细胞长满单层时进行传代，接种密度是1×106/ mL，细胞状态良好。镜检可见，长满单层的细胞紧贴于细胞壁，生长致密，呈长梭形，轮廓清晰，折光性强（如图1A）。将PEDV病毒接种在Vero细胞上，在30 h时出现明显的CPE，有部分细胞肿胀变圆，折光性增强，颗粒物质增多（如图1D），细胞对照未出现异常（如图1B）。培养48 h，细胞间隙变大，有少量细胞脱落（如图1E），对照细胞生长良好，仍然未见异常（如图1C）。在72 h时，细胞脱落已达80 %以上，细胞间隙变大、皱缩、融合，细胞单层形成网眼状，收毒（如图1F）。

图1 在不同时间点接种PEDV的Vero细胞产生的病变（20X）

3.2  细胞的纯净检测结果

3.2.1 Vero细胞的细菌、霉菌检测结果

用硫乙醇酸盐培养基（T.G）和葡萄糖蛋白胨培养基（G.P）

对Vero细胞进行检测，未见细菌、霉菌污染。

3.2.2 Vero细胞的支原体检测结果

用支原体培养基对Vero细胞进行检测，均未见支原体污染。

3.3  PEDV的鉴定结果

3.3.1 间接免疫荧光检测结果

取Vero细胞培养物接种长满单层的Vero细胞48 h后，经 PEDVN蛋白单克隆抗体间接免疫荧光检测，在未接种PEDV的Vero细胞中，未见到任何特异性绿色荧光斑点（图 2A），而在感染PEDV的Vero细胞中观察到大量特异性绿色荧光斑点（图 2B）。表明PEDV在Vero细胞中复制增殖。

图2 间接免疫荧光检测 PEDV（20 X）

3.3.2 RT-PCR检测结果

扩增产物片段约467 bp，与预期结果相一致（见图3）。

图3 PEDV的RT-PCR结果

3.4  PEDV滴度的测定结果

采用96孔板进行测定，在接毒后72 h，判定细胞病变，当病变细胞在80 %以上时，判定为病变细胞孔，进行TCID50的测定。按公式计算（Reed-Muech 氏法）结果见表1。

其确切稀释倍数可按下列公式计算：

将由上式获得的0.73加在高于50 %死亡的稀释度的对数（3）上，因此该病毒的 TCID50应是10-3.73/0.1 mL。

3.5  PEDV滴度的提高

3.5.1 不同的胰酶浓度对滴度的影响

设立了胰酶浓度分别为1 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL和75 μg/mL这10个浓度进行PEDV的培养，当胰酶浓度在50 μg/mL及以上时，PEDV无法进行培养。达到该浓度时可以观察到细胞拉网成堆，很难观察出病变。

表1 TCID50测定结果

图4 不同的胰酶浓度对病毒滴度的影响

3.5.2 不同吸附时间对滴度的影响

在培养PEDV毒株时，分别设立在37 ℃培养箱内吸附0.5 h、1 h、1.5 h和2 h后，加入无血清的DMEM溶液，72 h收毒，测定病毒滴度。

图5 不同吸附时间对病毒滴度的影响

3.5.3 不同培养方式对滴度的影响

培养PEDV时采用2种培养方式进行培养，分别为留吸附液和弃吸附液，之后在加入维持液，72 h收毒，测定病毒滴度。

图6 不同培养方式对病毒滴度的影响

4  讨论

近年来，有关PEDV疫苗的研究已经取得了一定的进展［3］，疫苗滴度的高低可以直接影响到疫苗接种的效果，因此准确测定疫苗滴度十分重要。本文通过改变胰酶终浓度、孵育时间和培养方式，来提高病毒的滴度，最终将PEDV的滴度维持在10-6.0/0.1 mL至10-7.0/0.1 mL之间。Hofinann和Wy1er实验表明，在培养PEDV时，若不加胰酶，那么PEDV感染细胞的能力会大大减弱，连续培养几代后，会使病毒在细胞上发生丢失［4］。所以PEDV的繁殖是有赖于胰酶的存在的。但是很多研究学者在培养PEDV时，对于胰酶的终浓度的选择都有一定的差别［5-6］。在本实验中，对PEDV HLJBX毒株进行培养时，设立了胰酶终浓度为1μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL和75 μg/mL这10个浓度进行PEDV的培养，结果表明当胰酶浓度在50 μg/mL及以上时，PEDV无法进行培养。达到该浓度时可以观察到细胞拉网成堆，很难观察出病变。在胰酶终浓度1～25 μg/mL之间，都适合PEDV的培养，但是在胰酶终浓度为2.5 μg/mL时，我们测得PEDV的病毒滴度高于其他组的病毒滴度。

本实验对不同吸附时间对病毒滴度的影响进行了研究，分别设立了0.5 h、1 h、1.5 h和2 h 4个时间点。结果表明，吸附时间为1.5 h，病毒的滴度最高，到2 h时病毒的滴度反而有所下降，但是下降不明显。这可能是由于吸附时间过长，导致一些状态不好的细胞贴在了培养瓶底部，因此影响了病毒的滴度。本实验还研究了不同培养方式对病毒滴度的影响，分别采用弃吸附液和留吸附液两种方式，结果发现采用弃吸附液的培养方式PEDV的病毒滴度明显比留吸附液的培养方式要高。这可能是由于在吸附液中存在一些感染能力较弱的病毒，当弃去吸附液后，感染能力较弱的病毒也随之弃去，那么感染细胞能力较强的病毒就会吸附在细胞上。如果留吸附液，对于感染能力较弱的病毒便会留在吸附液中，繁殖几代后便失去感染细胞的能力，从而影响了病毒的滴度。

［1］ 周靓靓，孙心，吴蕾. 猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻疫苗病毒培养条件的优化［J］.广东畜牧兽医科技，2014，39（6）：33-35.

［2］ 王琳，邢育钢，李继昌. 猪流行性腹泻病毒疫苗株在Vero细胞中繁殖条件的优化［J］.当代畜禽养殖业，2014(11)：3-4.

［3］ 王靓靓，李训良，李鹏冲，等. 猪流行性腹泻的诊断与预防［J］.世界华人消化杂志，2013，21（1）：33-38.

［4］ HOFMANN M，WYLER R.Propagation of the virus of PED in ce11 cu1ture［J］.J C1in Microbio1，1988，26：2235-2239.

［5］ 郝伟伟，邱文英，徐静，等.猪流行性腹泻病毒SZ株的分离与鉴定［J］.福建畜牧兽医，2012，34（6）：1-3.

［6］ 毛雅元，张桂红，葛俊伟，等.猪流行性腹泻病毒地方株LJB/ 03分离及培养特性［J］.病毒学报，2010，26（6）：483-489.

2016-07-17）

黑龙江省高校科技创新团队基金资助项目（2011TD001）

王靓靓（1987-），女，黑龙江哈尔滨人，兽医师，兽医硕士，主要从事工作：动物卫生监督和疫病防控。E-mail：383456366@qq.com 联系电话：18345587338

白会新（1986-），男，黑龙江望奎人，畜牧师，博士，研究方向：分子营养学与免疫学。E-mail：dqxmjbhx@163.com