合并支原体感染的大叶性肺炎患儿肺泡灌洗液中常规细胞学检测及意义*

王云霞，刘文光，谷强

（1.石河子大学医学院，新疆石河子832000；2.石河子大学医学院第一附属医院儿科，新疆石河子832000）

论著

合并支原体感染的大叶性肺炎患儿肺泡灌洗液中常规细胞学检测及意义*

王云霞1，刘文光2，谷强2

（1.石河子大学医学院，新疆石河子832000；2.石河子大学医学院第一附属医院儿科，新疆石河子832000）

目的研究大叶性肺炎患儿支气管肺泡灌洗液（BALF）中常规细胞学形态学检测、肺炎支原体-DNA（MP-DNA）及细胞因子白细胞介素-17（IL-17）水平，探讨其临床意义及相互关系。方法选取确诊为大叶性肺炎并行支气管肺泡灌洗术（BAL）的患儿87例，行BAL当天对患儿行临床肺部感染评分（CPIS）分为：重症组27例，轻症组60例；根据BALF免疫荧光定量MP-DNA结果，分为支原体感染73例：中拷贝组32例、高拷贝组41例，无支原体感染14例；ELISA法检测BALF中IL-17水平，对BALF中细胞HE染色后放大100倍计数，比较各组间常规细胞学计数百分比差异。结果BALF中中性粒细胞百分比（NE%）、淋巴细胞百分比（LY%）与血清中NE%和LY%无相关性（P＞0.05）；轻症组患儿BALF中柱状上皮细胞计数百分比高于重症组，并且重症组患儿BALF中巨噬细胞百分比高于轻症组（P＜0.05）；高拷贝组NE%高于中拷贝组（P＜0.05），且NE%与BALF中IL-17水平及MP-DNA拷贝均呈正相关（r1=0.49，P=0.000，r2=0.48，P=0.000）。结论大叶性肺炎肺泡灌洗液中成分更能反应大叶性肺炎局部炎症情况；大叶性肺炎发生时柱状上皮细胞受损脱落，同时巨噬细胞趋化聚集参与炎症反应；肺炎支原体感染时，IL-17通过中性粒细胞募集作用发挥抗感染能力，BALF中NE%可间接反映患儿局部感染支原体拷贝数。

大叶性肺炎；支原体感染；支气管肺泡灌洗液；常规细胞染色；白细胞介素-17；儿童

大叶性肺炎是常见的社区获得性肺炎之一，具有起病急、病情重和病程长等特点［1］。近年来大叶性肺炎患儿肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）感染率逐年上升，不但呼吸系统受累，还引起多系统损害，并且重症病例逐渐增多，严重时甚至引起死亡，引起广泛关注［2］。支气管肺泡灌洗术（bronchoalveolar lavage，BAL）是大叶性肺炎诊治的一种重要技术，可获得肺泡上皮表层液体中细胞成分和可溶性成分，其对于肺部疾病的机制研究及其诊治有重要的意义。研究大叶性肺炎患儿支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中常规细胞学形态学检测、肺炎支原体-DNA（mycoplasma pneumoniae deoxyribonucleic acid，MP-DNA）滴度及细胞因子白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）水平，可深入探讨大叶性肺炎免疫学机制，有利于疾病的诊治。

1　资料与方法

1.1一般资料

参照《诸福棠实用儿科学》儿童大叶性肺炎诊断标准［3］，选取石河子大学第一附属医院儿科2014年3月-2015年7月以大叶性肺炎收住并行BAL的患儿，共87例。其中，男48例，女39例，年龄3～14岁，平均（8.20±3.88）岁。操作过程中留取灌洗液。所有患儿入院均行血常规、胸片和肺部CT等检查，所获取BALF均进行细菌培养、免疫荧光MP-DNA及HE染色细胞学等检查。所选患儿行BAL前均未使用糖皮质激素或丙球蛋白等免疫调节药物。行BAL当天对患儿行临床肺部感染评分（clinical pulmonary infection score，CPIS），CPIS≥6分（27例）为重症组：年龄（8.22±4.35）岁，男17例，女10例；CPIS＜6分（60例）为轻症组：年龄（8.27±3.67）岁，男31例，女29例。CPIS是综合临床、影像和微生物学标准的评分系统，可用来评价大叶性肺炎的严重程度，大叶性肺炎评分≥6分为重度大叶性肺炎［4］。根据BALF免疫荧光定量MP-DNA结果，分为支原体感染组73例，其中：中拷贝组（MP-DNA：103～106）：32例，年龄（8.20±3.46）岁；高拷贝组（MP-DNA：106～）41例，年龄（8.38±3.03）岁；无支原体感染14例，年龄（8.39±3.54）岁。采用ELISA法对其中的1～79例患儿检测BALF IL-17水平，对BALF中细胞HE染色后放大100倍计数，比较各组间常规细胞学计数百分比（中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和柱状上皮细胞等）差异。各组间性别、年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2方法

1.2.1BALF采集所有患儿术前6 h禁食水，行BAL术前均由家长签订有创操作知情同意书，静脉镇静加2%利多卡因咽喉部局部麻醉，采用纤维支气管镜经鼻、咽喉、声门进入气道，检查各段支气管无新生物和其他病变后，结合术前胸片及肺CT的定位结果，寻找病变部位的支气管开口，37℃生理盐水灌洗受累的肺段，1.0ml/kg至少灌洗3次，总量不超过1.0～2.0ml/kg，随即负压吸引，至少30%灌输液被回收，留取肺泡灌洗液标本，缓慢拔出纤维支气管镜。获取新鲜BALF标本立即送往实验室行细胞学、MP-DNA和细菌培养等检查，留取标本3ml储存在-80℃冰箱，等待测定IL-17水平。

1.2.2实验测定MP-DNA：PCR试剂盒（PCR荧光探针法）由中山大学达安基因股份有限公司提供，PCR仪为美国ABIPrism7300基因扩增仪；BALF细胞检查：通过离心作用将一定数量的BALF细胞平铺于载玻片上，冷风吹干，无水乙醇中固定30min后进行HE染色，100倍光学显微镜下细胞分类计数；IL-17测定：双抗体夹心ELISA法测定，试剂盒由武汉优尔生商贸有限公司提供。以上操作步骤均严格按照说明书进行。

1.3统计学方法

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间均数比较采用t检验；非正态分布计量资料以中位数（四分位间距）表示，组间比较采用秩和检验；双变量符合正态性检验用Pearson相关分析，不符合则用Spearman相关，P＜0.05差异有统计学意义。

2　结果

2.1患儿BALF中相关指标的相关性

BALF中中性粒细胞百分比（neutrophilicgranulocyte%，NE%）、淋巴细胞百分比（lymphocyte%，LY%）与血清中NE%、LY%未发现相关性（P＞0.05）。见表1。

2.2重症组患儿与轻症组患儿相关指标比较

重症组患儿BALF中柱状上皮细胞百分比低于轻症组，并且重症组BALF巨噬细胞百分比高于轻症组差异有统计学意义（P＜0.05）；NE%、LY%和组织细胞百分比在两组间差异无统计学意义。见表2。

2.3高拷贝组与中拷贝组相关指标比较

高拷贝组NE%高于中拷贝组，差异有统计学意义（P＜0.05），LY%、巨噬细胞百分比、柱状上皮细胞百分比和组织细胞百分比在各组间差异无统计学意义。见表3。

2.4BALF中各指标的相关性

BALF中NE%与BALF中IL-17水平及MP-DNA拷贝均呈正相关（r1=0.49，P=0.000，r2=0.48，P= 0.000）。见表4。

表1　患儿BALF中NE%、LY%与血清中NE%、LY%相关性分析

表2　重症、轻症大叶性肺炎患儿肺泡灌洗液常规细胞计数比较%

表3　高拷贝组、中拷贝组患儿肺泡灌洗液常规细胞计数比较%

表4　BALF中NE%与IL-17、MP-DNA拷贝相关性分析

3　讨论

大叶性肺炎是儿童时期比较严重的下呼吸道感染性疾病，病原体感染时，肺局部抗感染能力较强，易出现较大炎症病灶，局限在一叶或多叶。本研究发现BALF中NE%、LY%与血清中NE%、LY%无相关性（P＞0.05），表明大叶性肺炎发生时，肺部局部炎症与全身炎症反应程度不平行，BALF中成分更能反应大叶性肺炎局部炎症情况。

正常人BALF细胞总数报道差别较大，约在9～26×106/ml，其中单核/巨噬细胞＞85%、淋巴细胞＜12%、中性粒细胞＜2%、嗜酸性粒细胞＜1%［5］。细胞总数和各组分比例改变可提示多种肺部疾病。假复层纤毛柱状上皮主要存在于呼吸道，其中柱状细胞最多，主要分布于气管、支气管、肺泡的腔面，具有保护和分泌功能，急慢性炎症可引起上皮细胞脱落并发生形态改变［6］。病原微生物感染可导致气道上皮的完整性破坏或纤毛柱状上皮细胞的鳞状化生或持续气道炎症，气道上皮被破坏越严重则病情越重。病菌侵入肺部呼吸道的第一道防线肺泡巨噬细胞大量趋化浸润，提呈抗原，吞噬脱落细胞，同时分泌促炎和抗炎细胞因子，在炎症反应过程中既是启动细胞，也是炎症因子作用的靶细胞［7］，对于控制病情有重要作用。BALF中巨噬细胞计数百分比升高可能提示大叶性肺炎病情较重。本文未对细胞形态学作进一步描述，BALF中细胞形态学值得进一步研究。

肺炎支原体是介于细菌与病毒之间能独立生存的最小微生物，无细胞壁。近年来，呈大叶性肺炎改变的支原体肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）有逐渐增多的趋势。高拷贝组BALF中NE%高于中拷贝组，差异有统计学意义（P＜0.05），并且NE%与MP-DNA拷贝呈正相关。肺炎支原体感染宿主后，巨噬细胞和树突状细胞摄取并处理抗原引起炎症反应。肺炎支原体可对上皮细胞造成持续损伤，使病原体易于在上皮细胞内定植并出现大量繁殖，BALF细胞学检查中性粒细胞比例升高［8］。本研究还发现BALF的NE%与BALF中IL-17正相关。在肺炎支原体感染时，IL-17能够刺激人支气管上皮细胞、肺纤维原细胞产生中性粒细胞，介导炎症反应。支原体侵犯肺部细胞时，IL-17通过强大的嗜中性粒细胞募集作用来清除病原体［9］，同时也刺激多种细胞产生大量前炎症因子，与之协同作用，放大炎症效应［10］。

综上所述，大叶性肺炎患儿BALF中常规细胞学检测对病情判断及支原体感染有重要意义：大叶性肺炎发生时柱状上皮细胞受损脱落，巨噬细胞趋化聚集参与炎症反应；肺炎支原体感染时，IL-17通过中性粒细胞募集作用发挥抗感染能力，BALF的NE%越高则局部支原体感染拷贝数越高。

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（曾文军编辑）

Cell suspension and level of IL-17 in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）of children with labor pneumonia combined with mycoplasma pneumonia and its clinical significance*

Yun-xiaWang1，Wen-guang Liu2，Qiang Gu2
（1.Medical College of Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832000，China；2.Departmentof Pediatrics，the First Affiliated Hospital of Medical College of Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832000，China）

Objective To explore cell suspension and level of IL-17 in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）of children with labor pneumonia combined with mycoplasma pneumonia and its clinical significance.Methods 87 children with labor pneumonia who had been done BAL were divided into CPIS≥6 group and CPIS＜6 group according to the clinical pneumonia infection score（CPIS）.Meanwhile，according to the results of MP-DNA，we grouped the children above into combined with mycoplasma pneumonia infection group and no mycoplasma pneumonia infection group，then combined with mycoplasma pneumonia infection group into group ofMP-DNA:103～106and group of MP-DNA:106～.ELISA method was used to detect IL-17 level，HE staining and microscopy to sort cells，PCR detect MP-DNA.Results The percentage of neutrophils and lymphocytes in BALF are not related to that in blood（P＞0.05）.The percentage of columnar epithelial cells in CPIS＜6 group were higher than CPIS≥6，how－ever，macrophagocyte was lower（P＜0.05）.The percentage of neutrophils are related with both MP-DNA（r=0.48，P=0.000）and IL-17（r=0.49，P=0.000）.Conclusions The composition of BALF is more appropriate to react the circumstance of lobar pneumonia.When lobar pneumonia occurs，columnar epithelial cells are damaged，macrophagocyte gathered to participate in the inflammatory response.In Mycoplasma pneumonia infection group，IL-17 raises neutrophils to resist infection，NE%in BALF can indirectly reflect the mycoplasma infection degree.

labor pneumonia；mycoplasma pneumonia infection；BALF；conventional cells staining；interleukin-17；children

R 563.11；R 725.6

A

10.3969/j.issn.1007-1989.2016.02.007

1007-1989（2016）02-0030-04

2015-11-10

兵团科技支疆计划项目（No：2013AB027）

谷强，E-mail：guqiang106@sina.com；Tel：18999538901