肿瘤环境下脂肪间充质干细胞旁分泌因子促进结肠癌细胞侵袭

陈冬梅，刘淑丹，马会明，刘晓明，梁雪云，魏 军

肿瘤环境下脂肪间充质干细胞旁分泌因子促进结肠癌细胞侵袭

陈冬梅1，刘淑丹1，马会明2，刘晓明1，梁雪云1，魏 军1

目的 确定肿瘤环境下人类脂肪间充质干细胞(hAMSCs)的旁分泌特征变化与肿瘤细胞侵袭的关系。方法 体外分离培养AMSCs,收集培养上清液制备条件培养基，用于培养HCT116细胞。利用Transwell培养板共培养AMSCs与HCT116细胞。通过检测穿透人工基底胶(Matrigel胶)的能力比较两种培养条件下HCT116细胞侵袭能力的差异。实时荧光定量PCR检测HCT116细胞上皮间质转化(EMT)相关基因的表达变化。ELISA法检测共培养后AMSCs基因表达和旁分泌因子表达变化。结果 结肠癌细胞系HCT116与AMSCs的Transwell共培养系统中，HCT116细胞的侵袭能力较AMSCs条件培养液培养显著增强。同时结肠癌细胞系HCT116构成的肿瘤微环境也影响了AMSCs旁分泌因子表达的变化，其中成纤维生长因子10(FGF10)、血管内皮生长因子C(VEGFC)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素10(IL-10)的表达较正常培养条件下显著上调。结论 肿瘤微环境影响下的AMSCs旁分泌因子表达改变，这些变化能够增强结肠肿瘤细胞的侵袭能力。

转移性；旁分泌因子；脂肪间充质干细胞；结肠癌

肥胖已成为发达国家和部分发展中国家共同面对的人口健康问题。肥胖与肿瘤的关系发生在机体的各个方面，在肥胖群体中，肿瘤的发生和不良预后均高于正常体重指数的群体[1]。有研究[2]显示肿瘤周围的脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，AMSCs)较骨髓间充质干细胞更易迁徙至肿瘤组织中，并伴随间充质细胞内皮化，说明AMSCs作为重要的肥胖相关的肿瘤微环境细胞可能在促进肿瘤细胞增殖和迁移中起了重要作用。同时AMSCs在提供肿瘤生长和血管形成方面的作用已被肯定，但是其对肿瘤细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是否有关键影响却报道很少[3]。肿瘤细胞的EMT是肿瘤发生远端转移的必然进程。因此阐明AMSCs在特定肿瘤微环境下对肿瘤细胞迁移的作用机制是重要的理论创新，对相关疾病的防治有重要的指导意义。该研究选取HCT116结肠癌细胞系与原代分离的AMSCs共培养，观察HCT116结肠癌细胞系的转移特性和AMSCs的旁分泌改变，从而阐明AMSCs影响HCT116结肠癌细胞系发生EMT的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人脂肪组织来源于宁夏医科大学总医院行腹部外科手术的非肿瘤患者，经医院伦理学委员会批准且获得患者知情同意。结肠癌细胞系HCT116由宁夏医科大学总医院人类干细胞研究所实验室保存。

1.1.2 主要试剂及仪器 胎牛血清(FBS)、DMEM ∶F12(1 ∶1)、胰蛋白酶、TRIzol(Invitrogen公司)； A型胶原酶(Roche公司)；反转录试剂盒和qPCR试剂盒(Fermentas公司)；山羊抗人多克隆抗体E-cadherin、vimentin (Santa Cruz 公司)；CY3标记兔抗山羊二抗 (博士德公司)；倒置荧光显微镜(Olympus公司)；CO2培养箱(Thermo公司)；定量PCR仪、电泳仪 (Bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 手术无菌条件下取脂肪组织，无菌运输至实验室。立即剔除系膜和血管组织，剪碎后置于1 g/L 胶原酶A中37 ℃消化1 h，1 500 r/min 离心10 min，弃去上清液和未消化漂浮组织，红细胞裂解液(155 mmol/L NH4Cl, 20 mmol/L Tris pH 7.6)裂解红细胞，1000 r/min 离心5 min，重悬于含15%FBS的DMEM ∶F12(1 ∶1)培养基中，以3.2×104个细胞/cm2密度接种于100 mm培养皿中，次日换液去除未贴壁细胞，37 ℃、5%CO2继续培养6 d，待细胞汇合至80%，即可传代，期间每2 d换液1次。HCT116细胞培养于含10% FBS的DMEM ∶F12(1 ∶1)培养基中。

1.2.2 条件培养基的制备 1×106个AMSCs培养24 h收集培养上清液，0.45 μm滤膜过滤，作为条件培养基继续用于培养HCT116细胞。

1.2.3 共培养系统 利用膜孔径为0.4 μm 的Transwell小室进行两种细胞共培养，下室接种AMSCs，上室接种HCT116，共培养于含10% FBS的DMEM ∶F12(1 ∶1)培养基中，共培养10 d，期间正常换液和传代，10 d后取出AMSCs，重新接种于无血清和添加因子培养基中培养24 h，收集上清液用于ELISA检测成纤维生长因子10(fibroblast growth factor 10, FGF10)、血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C, VEGFC)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)和白细胞介素10(interleukin-10, IL-10)的表达。HCT116细胞用做免疫组化、侵袭实验等。

1.2.4 ELISA检测 正常培养或与肿瘤细胞共培养后的AMSCs消化离心后，以4×105个细胞的密度重新接种于60 mm皿，无血清培养24 h，收集上清液用于ELISA检测，分别标记为对照组和共培养组。

1.2.5 细胞RNA提取及实时定量PCR 检测 收集正常培养、AMSCs条件培养基培养和与AMSCs共培养后的HCT116细胞，分别标记为对照组、条件培养基组和共培养组。TRIzol提取各试验组样本总RNA后，紫外分光光度计和电泳检测RNA浓度、纯度和完整性。通过随机引物体外逆转录获取cDNA，用SYBR Green染料法获得不同样本中目的基因的相对表达量。通过2-ΔΔCt算法，计算统计分析目的基因mRNA相对内参GAPDH基因表达水平的差异。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.6 免疫荧光染色 各处理组细胞经4%多聚甲醛固定，0.3%TritonX-100细胞膜穿孔10 min，根据二抗来源选择山羊或兔血清封闭30 min，E-钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)一抗(1 ∶100) 4 ℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，Cy-3或FITC荧光标记二抗室温避光孵育30 min，PBS洗涤3次，DAPI染核3 min，封片，倒置荧光显微镜下观察细胞特异性发光情况。

1.2.7 流式分析 流式细胞仪检测第3代AMSCs表面标志物CD105、CD90、CD73、CD34的表达，流式细胞术检测由BD FACSCaliburTMplatform完成。

1.2.8 成脂和成骨分化 分化培养基参考已发表文献[4]，成脂分化21 d后油红O染色，成骨分化21 d后茜素红染色。

1.2.9 肿瘤细胞侵袭实验 12 mm Transwell小室膜表面(8 μm孔隙大小)包被1 ∶5稀释的Matrigel基底膜基质40 μl，小室至于37 ℃孵化4～5 h形成凝胶。5×104个HCT116细胞重悬于200 μl 0.5%血清培养基中，接种至有凝胶的上室，500 μl 10%FBS的培养基补充至下室中。培养24 h后，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色光学显微镜下确定细胞迁移到基底膜背面的细胞数量。

2 结果

2.1 AMSCs的培养和鉴定 原代接种2 d后，AMSCs贴壁，生长出短臂，7 d后布满100 mm培养皿，传代培养后，细胞呈典型间质细胞样，梭形，漩涡样生长(图1A)。成脂诱导分化后能分化出油红O染色阳性的脂肪样细胞(图1B)，成骨诱导分化后能分化出茜素红着色的钙沉积颗粒(图1C)。流式细胞术检测该细胞中间充质干细胞表面标志物CD73、CD105、CD90阳性细胞占总细胞的90%以上，不表达造血干细胞标志物CD34(图1D)。

2.2 共培养后结肠肿瘤细胞系HCT116的形态和特征变化 正常培养的HCT116细胞呈上皮样、团簇样生长(图2A1)，表达上皮细胞标志物E-cadherin(图2B1)。与AMSCs共培养10 d后HCT116细胞发生间质样改变，伸展出短臂，游走至团簇之外(图2A2)，开始表达间质细胞标志物Vimentin蛋白(图2B2)。

2.3 共培养后HCT116细胞EMT相关基因表达变化 荧光定量PCR检测EMT相关基因ZEB1、Slug、Snail、Twist和E-cadherin的表达，结果显示与AMSCs共培养后的HCT116细胞中，间质相关基因ZEB1、Slug、Snail、Twist的表达上调，差异有统计学意义(FZEB1=87.762，FSlug=17.187，FSnail=83.332，FTwist=94.513，P<0.01)，而上皮标志基因E-cadherin表达下降，差异有统计学意义(FE-cadherin=135.060，P<0.05)。同时，通过AMSCs条件培养基进行的非接触性的培养发现，HCT116细胞中EMT相关基因Slug、E-cadherin表达较正常培养条件下无明显差异， ZEB1、Snail、Twist的表达上调(P<0.05)。见图3。

图1 AMSCs培养及特征鉴定

A：P1代AMSCs形态 ×40；B：成脂分化后油红O染色 ×100；C：成骨分化后茜素红染色 ×100；D：流式细胞术检测表面标志物

图2 共培养后HCT116细胞表型变化

A1：正常HCT116细胞形态 ×40；B1：E-cadherin ×200；C1：DAPI ×200；A2：共培养后HCT116细胞形态 ×40；B2：Vimentin ×200； C2：DAPI ×200

2.4 共培养后HCT116细胞侵袭性的改变 结果显示两种细胞共培养后，穿透Matrigel胶包被的Transwell基底膜的HCT116细胞数量显著高于正常培养和条件培养组，差异有统计学意义(F=279.377，P<0.001)。见图4。2.5 共培养后AMSCs旁分泌因子的变化 Transwell共培养与条件培养基培养后，HCT116细胞在迁移和侵袭能力上的差异，说明肿瘤微环境下的AMSCs的旁分泌因子组成发生了变化，导致HCT116细胞侵袭能力增加。进一步检测共培养后AMSCs的旁分泌因子的表达，结果显示：经过与肿瘤细胞共培养后，AMSCs分泌的FGF10、TNF-α、VEGFC和IL-10的表达显著高于正常培养条件下的分泌量(FFGF10=44.169，FTNF-α=10.915，FVEGFC=207.644，FIL-10=133.698，P<0.01)。见图5。

图3 HCT116细胞EMT相关基因表达变化

图4 共培养后HCT116细胞侵袭能力变化

图5 与肿瘤细胞共培养后AMSCs所分泌细胞因子变化

3 讨论

通常条件下，EMT在胚胎发育中发挥重要作用，同样在原始肿瘤的侵袭和迁移中EMT也普遍被认为起了关键作用。这一过程中上皮样肿瘤细胞顶-底极性消失，蛋白水解活性升高，侵袭细胞外基质的能力增高。顶-底极性是细胞中蛋白和脂质结构非均匀分布造成的，能抑制细胞的运动，以及细胞与其所处环境的交流。在EMT过程中，细胞丢失E-钙黏蛋白、紧密连接蛋白和细胞角蛋白等上皮标志基因，表现出N-钙黏蛋白、波形蛋白、纤连蛋白和α-平滑肌肌动蛋白等间质样表型[5]。实验证明，肿瘤微环境中的信号分子通过复杂的信号网络控制EMT，如表皮细胞生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、Wnt1、TGF-β和IL-6通过激活酪氨酸激酶受体(RTKs)、Wnt、TGF-β、NF-κB等信号通路，激活一组下游的转录调控因子：Snail、Slug、Twist 和ZEB1等[6-7]，可以诱导EMT和浸润性癌症的形成。获得间质表型的肿瘤干细胞亚群是肿瘤转移和复发的关键因素。本研究检测发现HCT116细胞与AMSCs共培养后获得了Snail、Slug、Twist 和ZEB1等基因的表达上调，E-cadherin上皮标志基因表达下降，并表达Vimentin蛋白，说明AMSCs促进了HCT116细胞的EMT发生。而AMSCs条件培养基培养的HCT116细胞在以上各间质标志基因的表达较共培养组低，说明肿瘤微环境造成了AMSCs旁分泌因子的改变。

肿瘤的微环境包括低氧、酸性、细胞外分泌因子等很多因素组成[8]。已有研究[9]显示，在结肠癌中，由环境中的肌成纤维细胞分泌的肝细胞生长因子(HGF)促进肿瘤细胞EMT和肿瘤起始能力，并伴随肿瘤细胞中Wnt通路高度激活。间充质干细胞(MSCs)能够在化疗中被激活，并分泌许多生长因子，包括：VEGF、EGF、IGF-1和HGF等；趋化因子SDF-1/CXCR4以及炎症细胞因子IL-6和TNF-α等，通过PI3K/AKT、Wnt和STAT3等信号通路保护肿瘤细胞免受化疗药物的损伤，并引发肿瘤细胞的EMT和干细胞特性[10]。这些研究证明肿瘤中的间充质干细胞通过细胞间通信对肿瘤细胞本身增殖、迁徙和侵略特性的影响。而对肿瘤微环境中的间充质干细胞本身特征改变的研究还非常少。本试验选取的HCT116结肠癌细胞系是含有β-catenin突变的细胞系，该细胞系表达包括Wnt1、Wnt3a等数种Wnt配体，能通过自分泌和旁分泌途径模拟体内环境下结肠癌肿瘤微环境[11]。来源于腹部手术废弃脂肪组织中分离的AMSCs，在与HCT116结肠癌细胞系共培养后，表达更高的生长因子IGF、FGF10、VEGFC，进一步ELISA检测结果显示肿瘤环境下的AMSCs表达更高的VEGFC、FGF10、TNF-α和IL-10，有报道[12]显示其中VEGFC是典型的促血管生成细胞因子，IL-10可能和肿瘤细胞的免疫豁免和逃逸有关[13]，而FGF10和TNF-α是与EMT直接相关的细胞因子[14-15]，其高表达证明肿瘤微环境下AMSCs更能够促进肿瘤细胞的生长和侵袭。AMSCs与肿瘤细胞之间的这种正反馈联系可能是通过细胞因子的旁分泌途径实现的，其中的具体机制还需要进一步研究。本研究阐明了肿瘤微环境下AMSCs旁分泌因子表达谱的改变影响了结肠肿瘤细胞的侵袭能力，研究细胞与微环境之间的关系将为更好地明确肿瘤发展的机制提供实验依据，对肥胖相关肿瘤临床诊疗提供理论指导。

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Chen Dongmei1，Liu Shudan1，Ma Huiming2，et al

Paracrine factors from adipose-mesenchymal stem cells enhance metastatic capacity of colon-cancer cell in tumor microenvironment

(1Human Stem Cell Institute of General Hospital，2Key Laboratory of Fertility Preservation andMaintenanceofMinistryofEducation,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004)

Objective To investigate the underpinning mechanisms by which human adipose-derived mesenchymal stem cells (hAMSCs) promote cancer metastasis remain elusive. Methods Colon cancer cells were co-cultured with AMSCs using a Transwell model. The capacity of invasion of HCT116 cells in the indicated conditions was detected by a Transwell invasive assay. The transcripts of EMT-associated genes in HCT116 treated with indicated conditions were determined by a qRT-PCR assay. Concentration of indicated paracrine factors and cytokines of the culture medium was ascertained by an ELISA. Results The results showed that AMSCs could promote colon cancer cells to a mesenchymal-like phenotype in a contact-dependent manner. Reciprocally, colon cancer cells were able to induce AMSCs to produce metastasis-related factors and cytokines, such as fibroblast growth factor 10 (FGF10), vascular endothelial growth factor C (VEGFC)，tumor necrosis factor-α(TNF-α) and interleukin 10 (IL-10) in part through a mechanism of an activation of tumor microenvironment. Intriguingly, an inhibition of contact with AMSCs led a reduced capacity of invasion of colon cancer cellsinvitro. Conclusion These findings thus suggest that the crosstalk between the microenvironment of cancer cells and paracrine factors of AMSCs has an implication in colon cancer malignancy. This study thus uncovers a novel paracrine factors mediated-crosstalk between colon cancer cells and AMSCs in colon cancer malignancy.

metastatic; paracrine factor; adipose mesenchymal stem cells; colon cancer

时间：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.018.html

宁夏自然科学基金(编号NZ13162)

1宁夏医科大学总医院干细胞研究所，银川 750004

2宁夏医科大学教育部生育力保持重点实验室，银川 750004

陈冬梅，女，博士，助理研究员；

魏 军，女，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：Lydiajunwei@163.com

R 73-37

A

1000-1492(2016)01-0036-06

2015-09-30接收