老年白内障患者晶状体中20s Proteasome的表达

李 卉 田 蕊 吴 怡 王陆飞 窦文文 张 辉

(吉林大学第二医院,吉林 长春 130041)



老年白内障患者晶状体中20s Proteasome的表达

李 卉 田 蕊 吴 怡 王陆飞 窦文文 张 辉

(吉林大学第二医院,吉林 长春 130041)

目的 探讨老年性白内障患者晶状体中20s Proteasome表达及酶活性的变化及其与白内障发病的关系。方法 分别应用Western印迹法及荧光标记蛋白质底物法检测老年性白内障患者晶状体中20s Proteasome的表达及酶活性变化。 结果 随着晶状体混浊程度及核硬度的增加，20s Proteasome的表达及酶活性均呈下降趋势。结论 在老年性白内障发病过程中，20s Proteasome与晶状体混浊程度相关。

20s Proteasome;老年性白内障;酶活性;晶状体

晶状体蛋白质结构改变可导致老年性白内障，晶状体中蛋白酶的异常分解可造成晶状体蛋白的不可逆变性〔1～3〕。20s Proteasome是哺乳动物细胞内数量最多的蛋白质酶体，具有糜蛋白酶样、胰蛋白酶样等活性，在哺乳动物细胞内蛋白质降解中具有重要作用〔4,5〕。在氧化应激条件下，20s Proteasome作为最主要的酶系统，参与组织细胞内氧化蛋白质降解〔6〕，随视网膜色素上皮细胞周期的增加，其20s Proteasome的表达降低，酶活性减弱〔7〕。20s Proteasome在晶状体中的相关研究尚未见报道。本实验检测老年性白内障晶状体20s Proteasome表达及酶活性的变化。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2009～2010年我院白内障科行非超声乳化小切口白内障手术的老年性白内障患者的晶状体，共20枚。其中女12例，男8例，年龄60～80岁，平均72.3岁。术前对病人进行筛查，除外并发性、代谢性、药物及中毒性、外伤性等类型的白内障。

1.2 实验试剂与仪器 蛋白酶抑制剂复合物(华特生生物技术有限公司)；硝酸纤维素膜〔PVDF膜(Amersham公司)〕；LLE-AMC(Biomol公司);预染蛋白Marker (北京全式金生物有限公司)；异硫氰酸荧光素(FITC)标记酪蛋白(Sigma-Aldrich公司)；20s Proteasome蛋白一抗(人源性抗体，日本滋贺医科大学第二生化教研室惠赠)；RP二抗(兔抗人抗体，中杉金桥公司);电化学发光(ECL)显色液 (北京全式金生物有限公司)。湿性转移电泳仪(大连竞迈生物科技有限公司)；UV-2500PC (日本岛津公司)；1700型紫外分光光度计(日本岛津公司)。

1.3 实验分组 依据晶状体混浊程度分为A、B两组，每组10枚。A组：软核或中等硬度核，颜色呈黄色、黄白色或深黄色。B组：硬核或极硬核，颜色呈棕黄色、琥珀色、棕褐色或黑色。

1.4 Western印迹检测晶状体中20s Proteasome表达 提取各组晶状体总蛋白，测定样品总蛋白浓度(A组为15.67 mg/ml，B组为61 mg/ml)，将其调至相同水平，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、湿性电转、蛋白印迹及显色反应。其中，20s Proteasome一抗(1∶10稀释)，4℃，过夜。二抗(1∶4 000稀释)，室温摇床摇2 h。最后利用Bandscan灰度扫描3次取均值。

1.5 20s Proteasome蛋白酶活性的测定 同上方法提取各组样品的晶状体蛋白，测定总蛋白浓度，调至相同水平；分别配置3种荧光标记蛋白底物；在37℃预热的Eppendorf管中加入一种荧光标记底物和组织上清液进行混匀，1 h后加入等体积的冰乙醇终止反应，立即读取荧光强度，激发光和发射光波长分别为 380 nm 和440 nm；计算反应体系中的游离 AMC 量(7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素)；最终结果为样本活性与空白对照活性的差值。20s Proteasome降解发荧光底物后，结合态的荧光素转变为游离态，在适当波长的激发光下可发出荧光。因而在底物饱和的体系中可以根据反应结束后的总荧光强度来测定被降解底物的量。 样本特定的酶活性(pmol·min-1·ml-1)是通过样本中每毫克蛋白每分钟降解荧光标记底物的皮摩尔(pmol)数来表示。

1.6 统计学处理 采用SPSS21.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 20s Proteasome在老年性白内障患者晶状体中的表达 在预染Marker带中蛋白分子量为30～40 kD位置附近检测到20s Proteasome的蛋白条带，与其分子量37 kD相符；且B组蛋白条带比A组浅，见图1。B组灰度值低于A组，见表1。

表1 两组晶状体20s Proteasome软件分析结果(n=10)

与A组比较：1)P<0.05；下表同

图1 20s Proteasome在老年性白内障患者晶状体中的表达

2.2 20s Proteasome在老年性白内障患者晶状体中酶活性的变化 B组肽酰谷氨酸肽(PGPH)、胰蛋白酶(T-L)、胰凝乳蛋白酶(CT-L)活性较A组均显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 20s Proteasome在老年性白内障患者晶状体中酶活性的变化±s)

3 讨 论

老年性白内障是最常见的白内障类型〔8,9〕，多种因素(如长期紫外线照射、氧化损伤等体内外相关因素)可导致晶状体老化后的退行性变。大部分学者认为晶状体蛋白的不可逆变性在白内障形成中发挥关键作用〔10～12〕。

人体内蛋白质含量最高的组织是晶状体，水溶性蛋白占90%以上〔13,14〕。晶状体蛋白的合成持续终生，晶状体纤维的有序排列保证了晶状体的屈光度和透明性。随着人年龄的增长，与代谢相关的酶活性下降，人的晶状体的代谢也相应减慢，导致晶状体透明度下降——白内障形成。其中，变化最为显著的是抗坏血酸、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽等许多抗氧化剂〔15〕。因此，老年性白内障主要的发生机制是氧化损伤和脂质过氧化影响晶状体纤维的有序排列。

20s Proteasome具有高效的降解作用，对人体组织细胞完成活跃的有氧代谢、大量蛋白质合成、快速细胞裂解等具有重要的意义〔16,17〕。作为具有多种功能的蛋白质降解酶，20s Proteasome负责清除氧化受损的蛋白质，在多种年龄相关性疾病中发挥重要的调节作用〔18～20〕。本实验发现随着晶状体的进行性混浊，20s Proteasome表达，同时，其酶活性减弱。其具体作用及机制尚有待进一步研究。

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〔2015-03-19修回〕

(编辑 苑云杰)

张 辉(1966-)，女，博士，教授，主要从事白内障病因学研究。

李 卉(1984-)，女，硕士，主治医师，主要从事白内障病因学研究。

R778

A

1005-9202(2016)20-5125-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.090