自体骨髓单个核细胞移植对脑梗死大鼠室管膜下区神经干细胞增殖的影响

蒋 超 孔维霞 朱 丽 罗 焕

郑州大学第五附属医院 1)神经内科 2)超声医学科 郑州 450052



自体骨髓单个核细胞移植对脑梗死大鼠室管膜下区神经干细胞增殖的影响

蒋 超1)孔维霞2)朱 丽1)罗 焕1)

郑州大学第五附属医院 1)神经内科 2)超声医学科 郑州 450052

目的 研究骨髓单个核细胞对脑梗死后脑源性神经营养因子(BDNF)及室管膜下区神经干细胞增殖的影响，探讨骨髓单个核细胞对脑梗死治疗作用的可能机制。方法 成年雄性SD大鼠 72只，体质量250～300 g。梯度离心法分离骨髓单个核细胞，流式细胞术检测细胞纯度，将由模型动物股骨骨髓腔内分离出的单个核细胞经尾静脉途径移植到大鼠体内；线栓法制作脑梗死动物模型，分别于脑梗死后24 h、72 h通过Western blot技术检测脑部BDNF的表达；室管膜下区神经干细胞的增殖情况于脑梗死7 d时通过BrdU/Nestin免疫荧光双染技术进行检测。结果 经骨髓单个核细胞移植24 h、72 h时，BDNF表达的水平在脑梗死大鼠脑部明显增高，与模型组及溶剂组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。自体骨髓单个核细胞移植还促进了脑梗死7 d时室管膜下区神经干细胞的增殖，骨髓单个核细胞移植组与模型组以及溶剂治疗组比较，差异亦具有统计学意义(P<0.01)。结论 自体骨髓单个核细胞移植可以显著增加脑梗死大鼠脑部BDNF的表达、并促进室管膜下区神经干细胞的动员。骨髓单个核细胞促进神经干细胞增殖的作用可能与骨髓单个核细胞的神经保护作用有关。

脑梗死；骨髓单个核细胞；脑源性神经营养因子；神经干细胞；神经营养作用

自体神经干细胞的增殖有利于脑梗死后神经功能的恢复，脑内神经的发生受多重因素的调节。缺血性或创伤性损伤可上调成年哺乳动物的内源性神经干细胞的增殖及分化[1，2]。在受损的脑组织，神经干细胞的增殖能力可被脑源性神经营养因子(BDNF)等外界的刺激物所加强[3]。既往研究表明骨髓单个核细胞具有促进神经系统内BDNF分泌的能力，但关于其对神经干细胞增殖影响的研究尚属少见。

1 材料与方法

1．1 实验动物与分组 成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠72只，体质量250～300 g，由郑州大学实验动物中心提供。所有操作程序均遵守郑州大学动物管理委员会规定。动物饲养、管理按二级动物标准进行。按随机化原则将所用实验动物分为4组，即假手术组(Control)、模型组(Ischemia)、溶剂治疗组(Vehicle)和骨髓单个核细胞治疗组(BMMNC)。每组每个时间点6只大鼠用于Western blot检测，每组6只用于荧光染色。

1．2 脑梗死动物模型制作 大脑中动脉局灶性脑缺血模型的制备采用线栓法[4]。腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉。假手术组只分离、暴露血管，不结扎颈总动脉及颈外动脉，不插入尼龙鱼线。模型组大鼠，仰卧固定，颈部正中切口，在颈内、外动脉分叉处结扎颈外动脉，并分离并暴露左侧颈总及颈内、外动脉，左侧颈总动脉剪口，插入头端烧成圆钝形尼龙鱼线，进线长度18～19mm，模型成功后，将颈总动脉连同尼龙鱼线一起结扎，缝合皮肤，放回笼内，单笼喂养。选择右上肢屈曲、行走时向右侧旋转或右侧肢体瘫痪的大鼠进行实验。

1．3 骨髓单个核细胞的分离、纯化 腹腔注射水合氯醛(0.4 g/kg)麻醉大鼠，在胫骨外侧皮肤上做一小切口，暴露胫骨，去除骨膜，利用牙科钻在胫骨上钻一1.25×2.5 mm的小孔直达骨髓腔，将一细针插入骨髓腔内，并连接到一个肝素化注射器上，通过前后移动细针，抽取骨髓，骨蜡封闭钻孔，缝合皮肤。将收集到的骨髓细胞进行离心，用含0.5%胎牛血清的磷酸盐缓冲液洗涤，将洗涤过的细胞悬浮于199培养基内，并将细胞悬液加入含20 mL淋巴细胞分离液的50 mL锥形瓶中、进行离心[5]。收集骨髓单核细胞，用含0.5%胎牛血清的磷酸盐缓冲液洗涤并进行细胞计数。然后将骨髓单核细胞悬浮于无菌冷磷酸盐缓冲液内，并达到所需的细胞浓度，备用；假手术组、模型组及溶剂治疗组亦经骨髓腔内抽出等量的骨髓细胞，假手术组、模型组不进行细胞移植，溶剂治疗组经尾静脉途径注射等剂量的生理盐水。取收集的骨髓单核细胞，制成细胞悬液，计数达1×106，1 000 rpm离心5 min，弃上清液，用PBS洗涤2次，取1 mL液体，轻摇离心管后，将骨髓单核细胞混匀，加入2 μL一抗(CD45)，室温孵育1 h，流式细胞仪上机检测。结果通过仪器CellQuest软件分析。

1．4 Western blot 检测脑梗死后BDNF的表达情况分别于脑梗死后24 h、72 h取脑组织，以RIPA裂解液冰浴下裂解并超声裂解梗死区的皮层组织。采用Bradford法测定蛋白含量，并将分离后的蛋白通过半干途径转移至PVDF膜上。将PVDF膜置于含5%脱脂奶粉的TBST溶液中室温封闭 2 h。加入一抗过夜后，用TBST溶液洗膜 3次，每次洗涤时间为10 min。然后将PVDF膜置于以辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育1 h。用TBST溶液洗膜3次，每次洗涤时间为5 min。X-射线胶片曝光后，对免疫印记条带的相对密度用电泳图像分析系统进行分析和定量[4]。

1．5 免疫荧光双染检测室管膜下区神经干细胞的增殖 于脑梗死后7 d取脑组织，冰冻切片置4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中(4°C)固定15 min。透膜封闭液封闭透膜2 h含5%脱脂奶粉的TBST中室温封闭 2 h。一抗过夜，二抗室温孵育切片。分别用PBS洗3次，每次5 min。荧光显微镜下，激发/发射波长488/525 nm的FITC呈绿色荧光，激发/发射波长550/565 nm的Cy3呈红色荧光。

2 结果

2．1 骨髓单个核细胞对脑部BDNF蛋白表达的影响 Western blot定量检测结果表明，对照组脑组织内BDNF蛋白的表达量较少，经骨髓源性单个核细胞治疗后其表达水平明显增高，而溶剂治疗组与模型组脑组织内BDNF蛋白的表达量仅略有增高。统计分析表明，骨髓源性单个核细胞治疗组与模型组、溶剂治疗组比较，结果均有统计学意义(P<0.01)。说明骨髓源性单个核细胞移植后脑部BDNF的分泌明显升高。见表1。

表1 脑梗死24 h、72 h时周围脑组织BDNF的检测结果 (OD目的条带/β-actin)

注：*与假手术组及溶剂治疗组比较，差异均有统计学意义，P<0.01

2．2 骨髓单个核细胞对室管膜下区神经干细胞增殖的影响 脑梗死7 d时室管膜下区神经干细胞增殖的荧光双染结果(双标阳性细胞数)：对照组2.98±1.01，模型组4.16±1.13，溶剂治疗组4.33±1.37，黄体酮治疗组12.35±2.92。对照组大鼠室管膜下区神经干细胞多处于静止状态，Nestin阳性细胞数量很少；缺血7 d时逐渐出现室管膜下区神经干细胞的活化、增殖，Nestin阳性细胞数增加，但是数量不多；经黄体酮治疗7 d后，室管膜下区BrdU/Nestin 免疫荧光染色双阳性的细胞数量明显增多。经统计学处理表明，4组之间比较，7 d时F(3，23)值为36.63(P<0.01)。组间两两比较的结果表明，黄体酮治疗组与模型组以及溶剂治疗组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；说明经黄体酮治疗后脑部室管膜下区的神经干细胞增殖数量明显增多，骨髓单核细胞不但具有神经营养作用，亦具有促进自体神经干细胞动员的能力。

3 讨论

细胞移植治疗有利于神经功能的恢复，对脑血管病具有潜在的治疗价值。动物实验研究结果表明，骨髓源性细胞是对脑梗死具有很高治疗价值的众多来源细胞中的一种。骨髓源性细胞主要包括骨髓基质干细胞(Bone marrow stromal cells BMSCs)与骨髓单个核细胞(Bone marrow mononuclear cells，BMMNCs)。骨髓基质干细胞是具有多种分化潜能的干细胞，该细胞移植可以减轻脑梗死后神经功能的缺损；且具有分离简单、不良反应少等缺点。然而骨髓基质干细胞的培养过程较为复杂，自体来源骨髓基质干细胞在急性及亚急性缺血性脑血管病患者的临床应用方面受到很大的限制。单核细胞在骨髓中亦占有一定的比例，骨髓单核细胞的成分主要包括间质细胞及造血细胞[5]。将骨髓单核细胞用于缺血性脑血管病治疗方面的研究目前在国内外鲜有报道。

脊椎动物脑部具有增殖能力的神经前体细胞主要位于前脑侧脑室附近的室管膜下区(SVZ)和海马齿状回颗粒下区(SGZ)，这些前体细胞具有分化为神经样细胞的能力、并行使一定的生理功能。神经营养因子家族的成员包含BDNF等，已有研究阐述了BDNF在脑梗死后神经发生过程中的作用。已有研究发现，将经BDNF转染的腺病毒通过立体定位注射的方式导入脑内，可以促进SGZ区神经干细胞的增殖，有助于神经发生及神经功能的恢复[6]。另有研究表明，经BDNF治疗的大鼠，其纹状体、下丘脑等脑室周围组织内新生神经元的数量显著明显[7]。所有上述研究均说明中枢神经系统内神经的发生与BDNF的神经营养作用密切相关。通过BDNF侧脑室注射除增加了SVZ区神经的发生外，亦在沿侧脑室和第三脑室排列的纹状体、隔区、下丘脑和海马中等特殊皮质结构发现BrdU阳性细胞数目均明显增多，且在上述区域新产生的神经细胞可表达神经元特异性标志物(Neun)和微管相关蛋白MAP2等。以上体内外实验研究均表明，BDNF促进神经发生的作用是其它类型神经营养因子所不能代替的，且通过提升BDNF的表达促进神经的发生可能对脑梗死的治疗具有重大意义[6]。

另有研究表明，中枢神经系统内神经的发生与脑梗死后神经功能的恢复关系密切[8-9]；该研究表明骨髓单个核细胞既促进了脑部神经营养因子的释放及室管膜下区神经干细胞的增殖，提示骨髓单个核细胞可能对脑梗死具有突出的治疗价值。关于骨髓单个核细胞促进BDNF分泌的可能机制尚有待于进一步的研究，如果骨髓单个核细胞在脑梗死方面的基础研究能够得到进一步的证实，必将为骨髓单个核细胞的临床应用提供更多理论依据。

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(收稿2016-04-20)

The influence of auto-transplantation with bone marrow mononuclear cells on proliferation of neural stem cells insubventricular zone in rats with cerebral infarction

JiangChao，KongWeixia，ZhuLi，LuoHuan

DepartmentofNeurology，theFifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052，China

Objective Our study aimed at investigating the effects of bone marrow mononuclear cells(BMMNCs)on brain-derived neurotrophic factors(BDNF)and on proliferation of neural stem cells in subventricular zone in rats with cerebral infarction，in order to explore the potential mechanisms of BMMNCs on cerebral infarction．Methods Totally 72 adult male Sprague-Dawley rats weighing 250 to 300 g were used in this study．We performed thread occlusion technique to establish the model of cerebral infarction．Mononuclear cells(MNCs)isolated from femoral marrow cavity were separated by using density-gradient centrifugation method and the purity of selected cells was identified by flow cytometer．Then the separated MNCs were transplanted into rats via tail vein injection．The expression of BDNF in brain was detected by Western blotting method at 24h and 74h after stroke and proliferation of neural stem cells in subventricular zone was tested by double BrdU/Nestin immunofluorescence staining on the seventh day after stroke．Results At 24 h and 72 h after auto-transplantation with bone marrow mononuclear cells，the expression of BDNF in transplantation group was obviously increased and showed statistical differences compared with model group and solvent group(allP<0.05)．Proliferation of neural stem cells in subventricular zone in the transplantation group was significantly improved，which presented statistical differences relative to both model group and solvent group(allP<0.05)．Conclusion BMMNCs can not only significantly increase the expression of BDNF but also effectively improve proliferation of neural stem cells in subventricular zone．The improvement of BMMNCs may be closely associated with the protective effect of BMMNCs．

Cerebral infarction；BMMNCs；Brain-derived neurotrophic factor；Neural stem cells；Neurotrophic effect

R-332

A

1673-5110(2016)20-0009-03