鹌鹑致病性大肠杆菌分离鉴定及抗生素敏感性试验

李章程，胡 洋，黄书伦，程方俊，伊光红，聂青青

（西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 荣昌 402460）

鹌鹑致病性大肠杆菌分离鉴定及抗生素敏感性试验

李章程，胡 洋，黄书伦，程方俊，伊光红，聂青青

（西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 荣昌 402460）

为确诊四川某养殖场产蛋鹌鹑死亡的病因，本试验采集病死鹌鹑的肝脏、心血等组织分离纯化细菌，并进行了细菌形态观察、生化特性检查、16S rRNA分子鉴定以及药物敏感性试验。结果显示：从肝脏、心血等组织中分离的细菌为致病性大肠杆菌；分离菌对环丙沙星、阿米卡星、大观霉素、链霉素、庆大霉素、头孢噻肟的敏感率均在84%以上，对氨苄西林、卡那霉素耐药。

鹌鹑；大肠杆菌；分离鉴定；抗生素敏感性

本试验采集四川某养殖场发病死亡的产蛋鹌鹑病料进行病原的分离与鉴定，然后进行抗生素药敏试验，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 四川自贡某鹌鹑养殖场发病死亡的产蛋鹌鹑。

1.1.2 试验动物 20只临床健康的七日龄鹌鹑，购于西南大学荣昌校区动物管理科。

1.1.3 主要试剂 麦康凯培养基等，细菌微量编码鉴定管，PCR试剂盒等，DNA Marker、核酸染色剂等，氨苄西林等10种常见药敏纸片。

1.2 方法

1.2.1 剖检变化 剖检150日龄病死鹌鹑，发现其心脏表面有一层灰白色纤维素性薄膜覆盖，心包积液严重；肝脏肿大；部分肠管粘连，肠黏膜充血；卵巢中卵泡变形、变性、有出血点，输卵管水肿，严重的呈卵黄性腹膜炎。

1.2.2 病原分离培养与细菌形态学检查 无菌采集发病鹌鹑的肝脏、心脏、肺脏等组织病料，分别接种于兔血营养琼脂平板和麦康凯琼脂平板，37℃培养24 h。分离纯化后，取麦康凯培养基上的红色菌落进行革兰氏染色，显微镜下观察细菌形态。

1.2.3 生化特性鉴定 对分离纯化的细菌进行糖发酵、吲哚、VP、MR、枸橼酸盐、三糖铁、氧化酶等试验，观察并记录结果。

1.2.4 药物敏感性试验 将分离纯化的试验菌接种于营养肉汤培养基中，37℃恒温培养24h后，将菌液制备成0.5个麦氏单位（1.5×109CFU/mL）的菌悬液。用灭菌棉球蘸取菌悬液，均匀涂布在琼脂平板表面，室温静置几分钟，无菌夹取药敏纸片贴放于培养基表面，药敏纸片之间的中心距离应大于30mm，37℃培养24h后，测量抑菌环的直径。

1.2.5 16S rRNA基因序列测定及系统发育分析 将分离菌接种于普通LB琼脂平板上培养24h，提取细菌基因组DNA进行PCR扩增，反应引物为细菌16S rRNA基因通用引物，反应体系参考吕朋沙等[1]的试验报告。PCR产物经过切胶回收后，由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

将分离菌株的16S rRNA基因测序结果与Gen-Bank公布的其他大肠杆菌的16S rRNA基因序列进行同源性比较，应用生物信息学软件DNAstar进行比对分析，并构建系统发育进化树。

1.2.6 动物致病性试验 选取3株分离菌接种于营养肉汤，37℃培养24h后，用灭菌生理盐水配制成细菌浓度为5×108CFU/mL的菌悬液备用。将健康鹌鹑随机分为4组，试验组每只腹腔注射0.2mL菌液，对照组不做处理正常饲喂，然后记录发病及死亡情况。

2 试验结果

2.1 细菌的分离与形态观察 分离株在兔血营养琼脂平板培养24h后出现圆形、凸起、光滑、湿润、灰白色的菌落，直径约2～3mm，不溶血；在麦康凯琼脂培养基上呈粉红色、中等大小、表面光滑湿润、不透明的菌落形态。将以上培养物经革兰氏染色镜检，观察到许多两端钝圆、散在分布的阴性短杆菌。

2.2 细菌生化特性 生化试验结果为三糖铁琼脂培养基斜面和底部呈现黄色，氧化酶阴性，吲哚、MR阳性，VP、枸橼酸盐阴性，且均能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇，与大肠杆菌的生化特性相符[2]。

2.3 药敏试验结果 根据2008年美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的标准判定[3]。结果显示该13株分离菌对氨苄西林和卡那霉素耐药，对链霉素、大观霉素、阿米卡星等8种抗生素敏感性较高。

2.4 16S rRNA基因扩增 随机选择3株菌，提取其基因组，扩增16S rRNA基因序列，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，得出目的基因扩增片段大小与预期条带基本相同，约为1500bp左右（见图1）。

图1 PCR扩增的16S rRNA电泳结果

2.5 系统发育分析 将生物公司的测序结果与GenBank中已知的10株大肠杆菌序列进行同源性比较分析，结果显示同源性为98.2%～99.6%，其中ZG-2、ZG-3、ZG-7与JN811622.1的同源性最高（为99.6%）。进化树分析表明，3株分离菌与JN811622.1 E.coli和HQ169124.1 E.coil为同一簇，亲缘关系最近。

2.6 动物致病性试验结果 试验组鹌鹑接种菌液17 h后普遍出现精神萎顿、腹泻、粪便呈灰黄色、食欲废绝、站立不稳、呼吸困难等临床症状，接种后24 h开始出现死亡，接种后48h全部死亡；而对照组鹌鹑健康无死亡情况。剖检死亡鹌鹑，可见肺部有出血点，肝脏和脾脏出现不同程度的肿大，心包膜粗糙并附着纤维素性分泌物。然后从死亡鹌鹑体内重新分离到了该致病菌的纯培养物。

3 讨论和小结

3.1 鹌鹑大肠杆菌病是常见疾病 随着鹌鹑养殖业的发展，鹌鹑的常见疾病越来越多，大肠杆菌病就是其中的一种。鹌鹑大肠杆菌病一年四季均可发病，鹌鹑一生都可感染，幼鹑和6月龄后的鹌鹑发病率较高[4]，本次试验的发病鹌鹑在5月龄预防，当养殖场暴发细菌病，应选用对细菌比较敏感的药物进行治疗。■

[1]吕朋沙，张菊，刘书超，等.鹅源沙门菌分离鉴定及系统进化分析[J].中国兽医杂志，2014，50（9）：10-13.

[2]布坎南 R E，吉本斯 N E.伯杰细菌鉴定手册[M].中国科学院微生物研究所《伯杰细菌鉴定手册》翻译组, 译.8版.北京：科学出版社，1984.

[3] National Committee for Clinical Laboratory Standards，Performance Standards for Antimicrobial disk Susceptibility Tests[S].Wayne PA：Approved Standard Second Edition，NCCLS，2003：M31-A2.

[4]丁伯良.特种禽类养殖技术手册[M].北京：中国农业出版社，2000：45.

[5] 张丽华，刘雷生，董群.一例鹌鹑大肠杆菌病的诊治[J].中国畜禽种业，2012（11）：142-143.

[6] 李忠显，刘洪敏.鹌鹑大肠杆菌病的诊断防治[J].畜牧与兽医，2005，37（2）：64.

[7] 兰玲，马亚珍.一起鹌鹑大肠杆菌病的诊断治疗[J].新疆畜牧业，2011（7）：54-55.

[8] 李沐森，姜成，吴斌.鹌鹑大肠杆菌病的诊治[J].特种经济动植物，2007，10（1）：20.

[9]刘建华，苑丽，李凤娟，等.鸭致病性大肠杆菌分离鉴定及药敏试验[J].中国畜牧兽医，2009，36（7）：161-163.

Isolation，Identification and Antibiotics Sensitivity Test of Escherichia Coli From the Quail

LI Zhangcheng，HU Yang，HUANG Shulun，et al.
（Department of Veterinary Medicine of Rongchang Campus，Southwest University，Chongqing Rongchang 402460，China）

To study the death cause of egg quails in a farm，some strains of pathogenic bacteria were isolated from liver and heart samples of sick quails.These strains were identified as E.coli by morphologic characters，biochemical identification，drug sensitive test and 16S rRNA sequence analysis，and they had strong pathogenic.The sensitive rates to ciprofloxacin，amikacin，spectinomycin，streptomycin，gentamicin and cefotaxime had more than 84%，meanwhile，they were resistant to ampicillin and kanamycin.

Quail；E.coli；Isolation and identification；Antibiotic sensitivity

S858.395.12

B

1001-8964（2016）04-0029-02

2016-01-20

西南大学教改项目（2014JY100）

李章程（1996-），男，云南宣威人，大学本科。

*通讯作者：程方俊（1962-），副教授。E-mail：cfj-xn@163. com.