宜宾烤烟赤星病致病力分化、生物学特性及抑菌药剂筛选研究

唐明 向金友 谢冰 程智敏 杨懿德 蔡毅 黄胜 杨苹 杨洋 易蔓 饶在生

摘 要：为了使生产上对烟草赤星病的防治更有针对性，对采自宜宾市烤烟种植区的具有典型赤星病症状的烟叶样品进行了组织分离、培养和形态特征观察。采用菌丝块创伤接种法测定分离菌株的致病性，同时采用菌丝生长速率法测定了不同致病力的菌株xs-k-1（较强）、xz-k-1（中）和xf-y-1（弱）的生物学特性及4种杀菌剂对较强致病力菌株xs-k-1的室内抑制效果。结果表明：21个菌株均属于链格孢菌，但各菌株间的致病力有明显的差异，平均病情指数为18.75～71.25，其中以中等致病力类型的菌株为主，占测试菌株的61.9%，弱致病力类型和较强致病力类型的菌株所占比例相当，未发现强致病力和不致病力菌株。在人工培育条件下，烟草赤星病菌在7～35 ℃的温度范围内均能生长和产孢，最适宜的生长和产孢温度为21～28 ℃；高湿度有利于病菌的生长和产孢，当湿度为100%时，病菌生长和产孢量最高，分别为5.83 cm和4.18×105 个·mL-1；在pH值4～10的范围内该病菌均能生长和产孢，适宜pH值范围为7～8.5，其中病菌生长的最适pH值为8.5，产孢量最大的pH值为7 。供试药剂的室内平板抑菌效果为：10%多抗霉素>60%唑醚·代森联>50%氯溴异氰尿酸>40%菌核净，10%多抗霉素的EC50为15.182 μg·mL-1。

关键词：烤烟；赤星病；致病性；生物学特性；药剂

中图分类号：S435.72 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.10.022

Abstract： To control Alternaria alternata with strong points， pathogen was isolated from the tobacco leaves with typical brown spot symptom. And the pathogen was cultured and the characters was observed. The pathogenicity of isolates was evaluated by mycelium block traumatic inoculation methods. The biological characteristics of representative isolates xs-k-1 （relatively strong）， xz-k-1 （moderate） and xf-y-1 （weak） with various pathogenicity were determined by using hyphal growth rate method. Moreover， the inhibition of 4 fungicides for relatively strong pathogenicity isolate xs-k-1 was investigated. The results showed that all of the 21 isolates were A. alternata， but the pathogenicity was different among different strains， and average disease index varied from 18.75～71.25. And the moderate virulent isolates distributed dominantly， accounting for 61.9%， the proportion of weak and relatively strong virulent type was the same， neither strong nor nonpathogenic. On PDA medium， mycelial can grow and spore in the temperature range of 7～35 ℃， with the optimum growth and sporulation occurring between 21～28 ℃. The high humidity was favorable for mycelial growth and sporulation， the growth and sporulation reached the highest under 100% RH， 5.83 cm and 4.18×105 individual·mL-1， respectively. Mycelial can grow and spore in the pH range of 4～10， and the suitable pH was 7～8.5， with the optimum growth pH 8.5， the optimum sporulation pH 7. The inhibition effects of different fungicides on A. alternata were 10%polyoxin> 60%pyraclostrobin & metiram> 50%chloroisobromine cyanuric acid> 40%dimetachlone， and 10%polyoxin EC50 values was 15.182 μg·mL-1.

Key words： flue-cured tobacco； Alternaria alternata； pathogenicity； biological characteristics； medicaments

烟草赤星病（Alternaria alternata）是烟草生产上对烟叶威胁最大的病害之一，属真菌性病害，具有潜育期短、流行速度快的特点[1-3]，在我国各烟区均有发生，以黑龙江、河南、山东、贵州、安徽、四川等省发生为害较重[4-6]，造成巨大的经济损失。宜宾是四川的重要烤烟产区之一，种植烤烟面积6 000 hm2左右，其烟叶风格独特，在主要卷烟品牌的主辅料中占有重要地位，对促进地方经济发展做出了重要贡献[7]。然而，地处高温高湿的宜宾烟区由于多年且大面积种植感赤星病的烤烟品种K326和云烟87等[8]原因，烤烟赤星病发生严重，一般烟田病株率为20%～60%，重病田可达90%以上，致使烟叶产量降低、品质下降，严重制约着烤烟生产的发展。为了生产中对烟草赤星病的防治更有针对性，急需明确宜宾各产烟县此病害的致病力、生物学特性以及不同药剂的抑菌效果。鉴于此，对宜宾烟区的烤烟赤星病菌致病力、生物学特性和不同药剂的抑菌效果进行试验，旨在为宜宾烟区赤星病的高效防治提供依据。

1 材料和方法

1.1 样品的采集

2015年6月至2015年7月在烟草成熟期，从宜宾筠连、兴文、珙县、屏山、长宁5个县烤烟种植区采集具有典型赤星病症状的烟叶样品，置于4 ℃冰箱保存，待分离。

1.2 供试药剂

根据中烟叶生[2015]24号文件及中国农药信息网（http：//www.chinapesticide.gov.cn/）选择供试药剂。10%多抗霉素WP（陕西绿盾生物制品有限责任公司）；40%菌核净WP（浙江斯佩斯植保有限公司）；60%唑醚·代森联WG（巴斯夫植物保护（江苏）有限公司）；50%氯溴异氰尿酸WP（河南银田精细化工有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 赤星病病菌的分离与鉴定 在采集样品的病健交界处切取边长约0.5 cm大小的组织块，用75%酒精消毒30 s，再用3% NaClO消毒约2 min后，用无菌水清洗3遍后用灭过菌的滤纸将组织块表面吸干，移植于PDA平板上，28 ℃培养，待培养3 d后对菌落进行纯化并单孢分离。将纯化的菌株在PDA平板上常规培养，记录菌落形态学特征，并挑取少许菌丝制成玻片在光学显微镜下观察孢子形态。参照关博元[9]的方法进行菌株产孢表型观察，并按具短分枝的孢子链，支链一般长1～5个孢子为链格孢和形成10～15个孢子长的分生孢子链，孢子链通常不分枝，个别分枝形成l～3个孢子的侧链为长柄链格孢。

1.3.2 赤星病菌株致病力的测定 将保存的赤星病菌株在PDA平板上28 ℃培养5 d后，用5 mm内径的打孔器在菌落边缘打取菌饼。采摘宜宾烟区主要栽培品种K326（感赤星病）中下部健康老熟叶片（叶片部位、叶色均匀一致），用75%的酒精棉球对烟叶表面消毒，用无菌水冲洗3次，晾干。每片烟叶以叶脉为分界，用灭菌针将烟叶表面对称的刺10个位点，每边5个位点。将有菌丝的饼面朝下轻贴于烟叶表面的针刺位点上，以无菌PDA培养基（直径5 mm）接种作对照，每菌株接种2张叶片。接种的离体叶片放在瓷盘（经紫外线灭菌）中的纱布（用灭菌水浸湿的四层灭菌纱布）上，然后用保鲜膜将盘口封严并置于28 ℃恒温箱内培养3 d。按病斑大小统计各接种位点的发病严重度，参照易龙等[10]的分级标准（表1），并根据公式A计算病情指数，确定各赤星病菌株致病力的强弱。

1.3.3 赤星病病菌生物学特性的测定 （1） 温度对赤星病菌生长的影响。将分离纯化的赤星病菌移植到PDA平板上，培养3 d后，用无菌打孔器在菌落生长边缘处打取直径为5 mm的菌饼。将病原菌菌饼移植于PDA平板上，分别置于7，14，21，28和35 ℃ 5个温度条件下培养，每个处理重复3次。5 d后采用十字交叉法和血球计数板分别测量菌落直径增长量和不同处理产孢量；（2） 湿度对赤星病菌生长的影响。参考Winton等[11]的方法，将不同饱和盐溶液倒入大培养皿，并用封口膜密封，造成不同相对湿度（RH，40%，60%，80%和100%）的试验环境。将PDA平板在50 ℃真空干燥箱中烘干，将赤星病菌饼（直径5 mm）移植于PDA平板中央，除去皿盖置入各不同RH的大培养皿中，在28 ℃下培养，每个处理3个重复。5 d后采用十字交叉法和血球计数板分别测量菌落直径增长量和不同处理产孢量；（3） pH值对赤星病菌生长的影响。用1 mol·L-1和1mol·L-1 NaOH调节PDA培养基pH值分别为4，5.5，7，8.5和10。将病原菌菌饼（直径5 mm）分别接种于不同pH值的PDA平板上，置于28 ℃恒温培养，每处理重复3次。5 d后采用十字交叉法和血球计数板分别测量菌落直径增长量和不同处理产孢量。

1.3.4 不同药剂对赤星病菌株抑制效果 试验以生长速率法（琼脂平板法）测定各药剂对赤星病菌株（xs-k-1）菌丝生长的抑制作用。所用培养基为PDA培养基，各化学药剂药液浓度分别为200.0，100.0，50.0，25.0和12.5 g·mL-1。在预培养3 d的菌落边缘打取5 mm直径的新鲜菌饼接种于不同药液浓度梯度的PDA培养基上，每皿1块，3次重复，以不加药剂的PDA培养基为空白对照，置于28 ℃培养箱中培养，5 d后采用十字交叉法测量菌落直径，取平均值，计算抑制率。

1.4 统计分析

数据处理采用Excel2007、DPS7.05和SPSS20.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 赤星病菌株的分离与鉴定

从采集烟叶样品上分离获得21个菌株（表2），其中兴文13株，筠连2株，长宁3株，珙县 1株，屏山2株。在PDA培养基上，初期为白色，后逐渐呈现灰黑色或暗绿色同心轮状菌落，菌落绒毡状，平整，扩展较快，与于莉等[12]报道基本一致。经显微镜观察发现，分生孢子单生或短链生，倒棒锤形或椭圆形，淡褐色至褐色，具2～6个横膈膜和1～3个纵、斜隔膜，孢身10～45×5.5～18 μm；在分生孢子梗上形成具短分枝的孢子链，支链一般长1～5个孢子，表现出链格孢菌的典型特征。

2.2 赤星病菌株致病力的测定

根据严重度分级标准和致病力强弱分化标准对21个菌株测定结果表明，供试菌株在鉴别烟叶（K326）上的平均病指为18.75～71.25，致病力存在明显的差异（表3），其中较强致病力菌株4个，占测试菌株的19.05%，中等致病力菌株13个，占测试菌株的61.9%，弱致病力菌株4个，占测试菌株的19.05%。上述结果表明，在宜宾烤烟种植区，中等致病力类型的菌株占有主导地位，弱致病力类型和较强致病力类型的菌株所占比例相当，未发现强致病力和不致病力菌株。

2.3 赤星病病菌生物学特性的测定

2.3.1 温度对赤星病菌生长的影响 温度对赤星病菌生长和产孢均具有显著性影响。试验结果（图1）表明，病菌在7～35 ℃的温度范围内均能生长和产孢。其中，病菌生长和产孢的适宜温度是21～28 ℃；在28 ℃温度下，病菌生长最大，产孢最多，分别为4.72 cm和4.2×105 个·mL-1。

2.3.2 湿度对赤星病菌生长的影响 试验结果（图2）表明，赤星病菌的生长和产孢均需要高湿度环境条件。病菌的生长随湿度增加逐渐增大，当湿度达到80%后病菌增长缓慢，且与湿度在100%时差异不显著；病菌的产孢量随湿度增加而显著增多，且在不同湿度条件下，病菌产孢量差异达极显著，当湿度达100%时，孢子数达到最大值，产孢量为4.18×105 个·mL-1。

2.3.3 pH值对赤星病菌生长的影响 在不同的酸碱度环境下，病菌的生长和产孢均具有明显差异。测定结果（图3）表明，赤星病菌在4～10的pH值范围内均能生长和产孢，病菌生长和产孢的适宜pH值为7～8.5，在pH值为8.5的PDA培养基上病菌生长最大，pH值为7的PDA培养基上产孢量最多。

2.4 不同药剂对赤星病菌株的抑制效果

从表4可以看出，各药剂对赤星病菌菌丝生长的抑制率均随药液浓度的增加而升高，且不同药剂的抑制效果有差异。比较EC50，10%多抗霉素对赤星病菌丝的抑制效果最好，EC50为15.182 μg·mL-1；40%菌核净对赤星病菌丝的抑制效果最差，EC50为50.818 μg·mL-1。

3 结论与讨论

采用组织分离法从宜宾植烟区采集的具典型赤星病症状的烟叶样品上分离赤星病菌，并进行致病性测定。结果表明，21个菌株在分生孢子梗上形成具短分枝的孢子链，支链一般长1～5个孢子，表现出链格孢菌的典型特征，但不同菌株的致病力差异明显，其中以中等致病力类型的菌株为主，占测试菌株的61.9%，弱致病力类型和较强致病力类型的菌株所占比例相当，未发现强致病力和不致病力菌株，这一现象可能与宜宾高温高湿的环境因素有关，也可能受样品采集的限制，宜宾地区烟草赤星病有无其他致病力菌株有待进一步研究。

目前有关烟草赤星病菌生物学特性研究的报道较多。本文通过对宜宾地区烟草赤星病菌的生物学特性研究表明，烟草赤星病菌在7～35 ℃的温度范围内均能生长和产孢，最适宜的生长和产孢温度为21～28 ℃；高湿度有利于病菌的生长和产孢，当湿度为100%时，病菌生长和产孢量最高，分别为5.83 cm和4.18×105 个·mL-1；在pH值4～10的范围内该病菌均能生长和产孢，适宜pH值范围为7～8.5，其中病菌生长的最适pH值为8.5，产孢量最大的pH值为7 ，这一研究结果与杜雷等[4]对安徽烟草赤星病菌生物学特性研究结果较一致。该试验结果可为宜宾烟区赤星病发生发展规律的预测预警提供参考。

室内平板抑菌试验结果表明，4种供试药剂对赤星病菌菌丝生长的抑菌效果为：10%多抗霉素>60%唑醚·代森联>50%氯溴异氰尿酸>40%菌核净。10%多抗霉素和60%唑醚·代森联对赤星病菌菌丝生长的抑菌效果显著，EC50值分别为15.182 μg·mL-1和19.828 μg·mL-1；40%菌核净抑菌效果最差，EC50为50.818 μg·mL-1，这可能是由于40%菌核净积年累月的使用导致赤星病菌对其产生了较强的抗性。

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