硫酸盐还原菌对煤系地下水水质的影响

刘 硕,葛晓光,漆 春,赵广秀

(合肥工业大学 资源与环境工程学院,安徽 合肥 230009)



硫酸盐还原菌对煤系地下水水质的影响

刘 硕,葛晓光,漆 春,赵广秀

(合肥工业大学 资源与环境工程学院,安徽 合肥 230009)

我国黄淮平原地区的煤田中,矿井井下揭露的地下水矿化度多在2～4 g/L,优势离子一般为SO42-,但有些矿井充水地层SO42-含量却很低。SO42-含量低的潘北矿煤系地下水中含有硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria,SRB),地下水在SRB作用下能发生脱硫酸作用。文章以实验的方法研究发现SRB能利用煤作为碳源,使地下水水质发生变化。脱硫酸作用后矿井水pH值升高,矿化度降低,硬度降低,SO42-、Ca2+及Mg2+质量浓度降低,CO32-和HCO3-质量浓度升高,Cl-、Na+、K+质量浓度不变。

硫酸盐还原菌;硫酸盐;脱硫酸作用;地下水;水质

在我国黄淮平原地区的煤田中,矿井井下揭露的地下水矿化度多在2～4 g/L,优势离子一般为SO42-[1]。但有些矿井充水地层SO42-含量却很低,如淮南矿区的潘北矿。这种SO42-低值异常现象与通常的水文地质化学规律相悖[2]。脱硫酸作用是一项基本的水文地球化学作用[3],通常发生在含有机质的还原环境中,该作用是由硫酸盐还原细菌(sulfate-reducing bacteria,SRB)导致的[4-6]。已有相关研究证实这类地下水中存在硫酸盐还原菌[2,5,7-8],虽然证实了煤系地下水可发生脱硫酸作用[9],但是对该作用对煤系地下水水质影响的研究并不深入。本文以实验的方法,选取SO42-含量异常的潘北矿矿井水作为菌种来源,研究硫酸盐还原菌对SO42-含量正常的濉肖矿区刘桥二矿矿井水水质的改变,以确认造成两矿矿井水水质差异的部分原因为脱硫酸作用。

1 实验材料与方法

1.1 样品采集

菌样取自淮南矿区潘北矿-490 m深井,终孔层位在石炭系太原组,水温38.4 ℃,水质为Na-Cl·HCO3-型,水略有臭味。用2个灭菌后的500 mL磨口玻璃瓶接取钻孔水,充满后盖紧瓶塞,用PTEE胶带缠封瓶口,通过便携式保温箱携带,当天送往实验室,4 ℃保存备用。

水样取自濉肖矿区刘桥二矿-650 m深井,终孔层位在二叠系煤系砂岩含水层,水温39.2 ℃,水质为Ca-SO42-型。煤样取自刘桥二矿下二叠系山西组煤层,取样方法为刻槽法,煤样所在层位距离水样所在含水层法向距离约15 m。

1.2 实验过程

将含菌矿井水取5 mL接种进Postgate B[10]培养基中,放入恒温培养箱(SKP-01B型)40 ℃厌氧培养5 d。采用平皿压层厌氧法[11],用Postgate E[10]培养基进行细菌的分离。用Postgate C[10]培养基进行细菌的扩大繁殖。如此反复进行3次分离纯化,可得到1株较纯菌株,命名为S890。

本实验的培养装置采用容积为500 mL的磨口锥形瓶,设置3个平行对照组,编号为A、B、C组。将所取煤样放入干燥箱(DHG-9010-2SA型)在110 ℃下干燥5 h。磨成粉末(JP-150A-8粉碎机),过200目筛[1],称取20 g,用聚丙烯无纺布包裹3层,用自锁式尼龙扎带捆扎,将包好的煤样放入锥形瓶中。取500 mL水样放入锥形瓶内,用纱布密封瓶口。将密封好的锥形瓶和瓶塞放入灭菌器(YXQ.SG41.280手提式)在0.15 MPa下高温灭菌30 min[12],待锥形瓶冷却后去掉密封的纱布,在瓶塞处涂抹凡士林,盖上瓶塞,放入无菌操作箱浸泡煤粉2 h。浸泡后加入1 g FeCl2粉末,放入超声波清洗器(KQ-300DE型)中加速溶解,溶解后接种[12]2 mL纯化后的菌种。接种后以200～300 mL/min的流量通入高纯氮(99.99%)置换培养基中的溶解氧(dissolved oxygen,DO),直到DO(AZ-8403溶氧仪)值小于0.2 mg/L后密封。密封时在瓶口处涂抹凡士林,保证良好的密封性,密封后放入培养箱(SKP-01B型)内培养。

每天测量培养液的pH值(AZ8686pH笔)、氧化还原电位(oxidation-reduction potential,ORP)(CL200笔式ORP计)和各离子质量浓度(包括SO42-、硫化物、Cl-、Na+、K+、Ca2+、Mg2+)。由于测CO32-和HCO3-质量浓度取样量较大,所以只在第1天和第5天测量。pH值、ORP的测量和取样过程均在有机玻璃真空手套箱中进行以保证厌氧环境。

第5天将3组锥形瓶用漩涡混合器进行震荡,待固液混合均匀每瓶抽取50 mL溶液分装到5个10 mL的离心管中,以5 000 r/min离心5 min(DM0412离心机),去清后取得固体沉淀。离心后每组取其中1管沉淀直接冷冻干燥[13]48 h(FD-1C-50冷冻干燥机),做X射线光电子能谱分析(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)(ESCALAB25型X射线光电子能谱仪,美国Thermo);再将1管沉淀冷冻干燥48 h,进行扫描电子显微镜分析(scanning electron microscope,SEM)(SU8020场发射扫描电子显微镜,日本Hitachi);将剩余的3管沉淀固定、脱水、冷冻干燥[14-15]后进行SEM分析。做SEM时固体样品处理方法不同是因为对细菌做扫描电镜必须进行固定、脱水。

离子成分定量分析:SO42-和Cl-质量浓度用离子色谱法测量(IC6200型离子色谱仪);硫化物质量浓度用亚甲基蓝分光光度法测量[16-17];CO32-和HCO3-质量浓度用盐酸滴定法测量[18];阳离子(Na+、K+、Ca2+、Mg2+)质量浓度用电感耦合等离子体发射光谱仪(Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry,ICP-OES)(PQ900,德国耶拿)测量。

2 实验结果与分析

2.1 细菌检测结果分析

将新采集的潘北矿矿井水和培养结束后的培养液冷藏保存寄往上海生物工程公司进行高通量基因测序,从而确定细菌种属并分类。

潘北矿矿井水细菌按门分类结果见表1所列,其中变形菌门细分到纲。

表1 细菌群落在门分类水平的细菌组成

提取DNA后,使用细菌的16S rRNA通用引物对所提取DNA进行聚合链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增,扩增区域为细菌的V3—V4区。PCR所用的引物已经融合了Miseq测序平台的通用引物。PCR结束后,对PCR产物进行琼脂糖电泳,采用生工琼脂糖回收试剂盒(cat:SK8131)对DNA进行回收。利用Qubit2.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量,利用Miseq测序平台进行基因测序。经 PCR扩增和基因测序后,将获得的基因序列在GenBank DNA 数据库中进行BLAST对比,确定细菌的种属并分类[19-23]。

将实验第5天所采集菌样的检测结果在NCBI网站进行BLAST相似性检测,比对GenBankDNA序列数据库,进行同源分析,选取一批与该菌株同源性高的菌株序列,应用MEGA5.1软件中的NJ法建立系统发育树,如图1所示。

图1 菌株S890和相关菌的基因序列系统发育树

检测结果表明,煤系地下水中细菌种类非常丰富,其中变形菌约占总数的87%。变形菌中α变形菌约占9%；β变形菌约占16.4%；γ变形菌约占19%；δ变形菌约占5.21%,ε变形菌约占37.39%。

其中δ变形菌中的Desulfovibrio属于SRB类,约占细菌总数的4%。

分离提纯培养后的S890的基因序列为:

GGGGAATATTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGAAGGTCCTCGGATCGTA

AACCTCTGTCAGGAGGGAAGAACCGCCACGGTGCTAATCAGCCGTGGTCTGACGGTACCTCCAAAGGAAGCA

CCGGCTAACCCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATCACTGGGCGTAAA

GCGCACGTAGGCTGCTTGGTAAGTCAGGGGTGAAAGCCCGCGGCTCAACCGAGGAATTGCCTTTGATACTGC

CGAGCTAGAGTCCGGGAGA GGGTAGTGGAATTCCAGGTGTAGGAGTGAAATCCGTAGAGAGCTGGAGGAA

CATCAGTGGCGAAGGCGACTACCTGGACCGGTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACA。

从基因发育树可以看出,菌株S890与Desulfovibriopigro及Desulfovibriopiger序列的吻合度最高,因此S890应属于脱硫弧菌属Desulfovibriosp.。

2.2 XPS结果分析

对第5天处理后的3组固体沉淀充分混合后进行XPS分析,得到了针对S元素的S2p结合能-丰度关系谱图。S元素的结合能-丰度谱图用XPSPEAK4.1分峰软件进行分峰,分峰结果如图3所示。图3中FeS在161.2 eV处成峰;SO42-在168.5 eV处成峰[24-25]。从分峰结果可以看出S元素主要以FeS和SO42-形式存在,固体沉淀中FeS占优。

图2 S元素结合能-丰度谱图

2.3 SEM结果分析

将第5天处理所得2类固体样品喷金做扫描电镜。扫描电镜照片如图3所示,图3中，细菌大多为短弧状,大小在(0.4～0.8 μm)×(1.5～2.0 μm),固体成分为絮状胶体,未看到结晶。

图3 扫描电镜照片

2.4 离子成分变化结果分析

将每天所测离子成分绘制成Piper三线图,如图4所示。其中第2～4天的HCO3-和CO32-质量浓度采用内插法计算求得。从图4可以看出在培养过程中Na++K+质量浓度稳定;Ca2+和Mg2+质量浓度降低;Cl-质量浓度较稳定;HCO3-和CO32-质量浓度升高;SO42-质量浓度大幅降低。硫化物质量浓度升高,多以沉淀形式存在,其质量浓度随时间变化如图5所示。

图4 离子Piper三线图

图5 硫化物质量浓度随时间的变化

2.5 pH值和ORP结果分析

在整个培养过程中每天测量pH值和ORP,测量结果绘制成折线图,如图6所示。从图6可以看出,整个过程pH值升高,最高可达8.9;ORP降低,最低达到了-460 mV。

图6 pH值、ORP随时间变化曲线

3 结果讨论

硫酸盐还原细菌(SRB)是一类形象和营养多样化、利用硫酸盐作为有机物异化作用电子受体的兼性厌氧微生物。SRB会将硫酸盐还原为硫化物,并产生CO2和OH-。反应过程[26-27]如图7所示。

图7 硫酸盐还原反应过程

这个过程是在厌氧条件下强酸盐变为了弱酸盐,并产生了OH-,所以培养基pH值升高。细菌在分解代谢过程中消耗了SO42-和碳源,生成了S2-和CO2。

培养基pH值升高,会破坏水中的碳酸平衡,当pH>8.34时HCO3-会转化为CO32-,水中的Ca2+和Mg2+会使之沉淀,导致Ca2+、Mg2+、CO32-、HCO3-质量浓度降低。由于细菌的分解代谢作用,将碳源分解生成了CO2,且生成量远多余于CO32-、HCO3-的沉淀量,所以最后溶液中CO32-、HCO3-质量浓度升高。细菌代谢消耗了SO42-,产生的CO32-、HCO3-和S2-会被Ca2+、Mg2+和重金属离子沉淀,所以总矿化度降低。Ca2+、Mg2+质量浓度降低使水的硬度降低。

脱硫酸作用的还原产物主要以FeS形式存在,在40 ℃时FeS在pH值为 6.5～12.5,Eh(ORP)为-300～-700 mV时稳定,如图8所示[28-32]。

图8 40 ℃时Fe-S系统Eh-pH图

将所得结果与矿井地下水水质资料结合分析可知:封闭性较好的煤系地层,地下水处于还原环境,有利于SRB生存,这些矿井一般SO42-质量浓度较低,CO32-、HCO3-质量浓度相对较高,Ca2+、Mg2+质量浓度相对较低;封闭条件较差的矿井,地下水还原环境不好,不利于SRB生存,这些矿井一般SO42-质量浓度较高,CO32-、HCO3-质量浓度相对较低,Ca2+、Mg2+质量浓度相对较高。地下水水质资料见表2所列[1]。

表2 各矿井地下水水质情况 mg/m3

4 结 论

基因检测结果表明，还原环境较好的潘北煤矿煤系地下水中细菌种类丰富,存在硫酸盐还原菌。硫酸盐还原菌能利用煤粉浸出液作为碳源,利用矿井水作为反应底物,且作用后会使环境的氧化还原电位降低,形成还原环境。

在硫酸盐还原菌作用下煤系地下水的水质发生变化:pH值升高,SO42-、Ca2+及Mg2+质量浓度降低,CO32-、HCO3-质量浓度升高,总矿化度降低,硬度降低。

[1] 奚伟学.淮北平原区太原组岩溶含水层的水岩硫分及其同位素成因分析[D].合肥:合肥工业大学,2014.

[2] 葛晓光,杨柳,叶永康,等.煤系地下水的硫酸盐还原菌与水文地球化学效应[J].煤炭学报,2012,37(2):237-241.

[3] 张人权,梁杏,靳孟贵,等.水文地质学基础[M].北京:地质出版社,2011:62.

[4] ODOM J M,SINGLETON R,Jr,POSTGATE J R.The sulfate-reducing bacteria:contemporary perspectives[M].London:Springer London Limited,2011:1-40.

[5] WAWRIK B,MENDIVELSO M,PARISI V A,et al.Field and laboratory studies on the bioconversion of coal to methane in the San Juan Basin[J].FEMS Microbiology Ecology,2012,81(1):26-42.

[6] WENTZEL A,LEWIN A,CERVANTES F J,et al.Deep subsurface oil reservoirs as poly-extreme habitats for microbial life:a current review[J].Cellular Origin,Life in Extreme Habitats and Astrobiology,2013,27:439-466.

[7] AN D,CAFFREY S M,SOB J,et al.Metagenomic of hydrocarbon resource environments indicates aerobic taxa and genes to be unexpectedly common[J].Environmental Science &Technology,2013,47(18):10708-10717.

[8] 葛晓光,杨柳,彭申华,等.一株煤矿地下水硫酸盐还原细菌的分离、鉴定及性质研究[J].合肥工业大学学报(自然科学版),2011,34(3):420-423.

[9] 章至洁,韩宝平,张月华.水文地质学基础[M].徐州:中国矿业大学出版社,1995:90-91.

[10] POSTGATE J R.The sulphate-reducing bacteria[M].2nd ed.Cambridge,England:Cambridge University Press,1984:5-28.

[11] 万海清,苏仕军,葛长海,等.一种分离培养硫酸盐还原菌的改进方法[J].应用与环境生物学报，2003,9(5):561-562.

[12] 汤浩.煤系地下水硫酸盐还原菌和产甲烷菌的共生性研究[D].合肥:合肥工业大学,2014.

[13] 姚静,张自强.药物冻干制剂技术的设计及应用[M].北京:中国医药科技出版社,2007:2-3.

[14] 梁静南,刘一苇,谢家仪.植被细菌类单细胞生物扫描电镜样品方法的改进[J].电子显微学报，2013,32(3):276-278.

[15] 陈雪华,江俊.水中杆状细菌的扫描电镜观察[J].热带农业科学,1998(4):24-25.

[16] 王娟.烟气氢氧化钠循环吸收-微生物还原回收单质硫的研究[D].南京:南京理工大学,2013.

[17] 国家环境保护局科技标准司.水质 硫化物的测定 亚甲基蓝分光光度法:GB/T 16489—1996 [S].[S.l.:s.n.],1996：1-5.

[18] 中华人民共和国地质矿产部.地下水质检验方法：DZ/T 0064.1～0064.80—93 [S].[S.l.:s.n.],1993:143-146.

[19] 江云飞,凌宏志,蔡柏岩,等.大麻沤麻液中细菌的分离和鉴定[J].中国麻业科学,2008,30(5):279-286.

[20] 李晓然.基于核糖体 RNA 高通量测序分析微生物群落结构[D].上海:复旦大学,2011.

[21] 李晓然,李洁,刘晓峰,等.利用高通量测序分析云南豆豉中细菌群落多样性[J].食品与生物技术学报,2014,33(2):137-142.

[22] 赵光,马放,孙婷,等.基于高通量测序的寒地沼气池微生物群落解析[J].哈尔滨工业大学学报,2014,46(4):36-42.

[23] 黄会静.焦化废水处理的硫氰化物降解功能菌特性研究[D].广州:华南理工大学,2011.

[24] ZHENG B,LIU H.Electrochemical sulfide removal on carbon electrode in sulfate reducing bacteria microbiological fuel cell[J].ECS Transactions,2014,58(35):1-9.

[25] LIANG P,WU H,ZUO G,et al.Tribological performances of heterocyclic-containing ether and/or thioether as additives in the synthetic diester[J].Lubrication Science,2009,21(3):111-121.

[26] 方艳,闵小波,柴立元,等.硫酸盐还原菌生理特性及其在废水处理中的应用[J].工业安全与环保,2006,32(5):17-19.

[27] CYPIONKA H.Solute transport and cell energetics[J].Biotechnology Handbooks,1995,8:151-184.

[28] WEI D,OSSEO-ASARE K.Particulate pyrite formation by the Fe3+/HS-reaction in aqueous solutions:effects of solution composition[J].Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects,1996,118(1):51-61.

[29] 易平贵,刘俊峰,金一粟.FeS2-H2O系综合平衡电势-pH图及其应用[J].湘潭矿业学院学报,1999,14(1):44-49.

[30] BIEMAT R J,ROBINS R G.High-temperature potential/pH diagrams for the iron—water and iron—water—sulphur systems [J].Electrochimica Acta,1972,17(7):1261-1283.

[31] 李超,张祉倩,李宏煦.难浸金精矿生物浸出体系的电位-pH图分析[J].黄金科学技术,2014,22(2):77-82.

[32] 马运柱,熊翔,黄伯云.硫化矿物—H2O体系中Eh—pH图形数据库系统的开发及应用[J].矿冶工程,2001,21(4):33-36.

(责任编辑 张淑艳)

Effect of sulfate-reducing bacteria on groundwater quality in coal measures

LIU Shuo,GE Xiaoguang,QI Chun,ZHAO Guangxiu

(School of Resources and Environmental Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

In the coal mine of Huang-Huai Plain in China, the groundwater salinity of underground mine is mostly at 2-4 g/L, and the advantage ion is SO42-generally. But the content of SO42-at some water filling formations is very low. There are sulfate-reducing bacteria(SRB) in the groundwater of Panbei coal mine with low content of SO42-. Desulfurization can occur under the action of SRB. In this paper, it was found that SRB could use coal as carbon source to change the groundwater quality. After the desulfurization, the pH value increased, the salinity, water hardness and the content of SO42-, Ca2+and Mg2+decreased, the content of CO32-and HCO3-increased, and the content of Cl-, Na+and K+was unchanged.

sulfate-reducing bacteria(SRB); sulfate; desulfurization; groundwater; water quality

2015-06-10；

2015-07-06

国家自然科学基金资助项目(41172216)

刘 硕(1989-),女,河北保定人,合肥工业大学硕士生;

葛晓光(1956-),男,安徽淮南人,博士,合肥工业大学教授,硕士生导师.

10.3969/j.issn.1003-5060.2016.10.021

P641.11

A

1003-5060(2016)10-1401-06