单唾液酸神经节苷脂对急性低压氧脑水肿后MMP9表达的影响

李虎 刘洪 王百忍 巩固

(1成都军区总医院麻醉科，四川 成都 610083; 2川北医学院麻醉科，四川 南充 637000; 3第四军医大学全军神经科学研究所，陕西 西安 710032)

·论著·

单唾液酸神经节苷脂对急性低压氧脑水肿后MMP9表达的影响

李虎1,2刘洪1,2王百忍3巩固1*

(1成都军区总医院麻醉科，四川 成都 610083;2川北医学院麻醉科，四川 南充 637000;3第四军医大学全军神经科学研究所，陕西 西安 710032)

目的观察单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)对急性低压氧后基质金属蛋白酶9(MMP9)表达的影响，探讨MMP9在GM1预防低压氧脑水肿中可能的机制。方法24只雄性C57BL/6小鼠随机分成4组(n=6)：分别为对照(control)组、急性低压氧(HH)组、GM1治疗(GM1+HH)组、单纯给药( GM1)组。control组：置于低压氧舱外的常氧舱内；HH组：置于6 000 m海拔模拟舱内24 h；HH+GM1组：连续腹腔注射GM1 3 d(30 mg/kg)，最后一次给药后30 min行急性低压氧处理，方法同HH组；GM1组：前期GM1处理同HH+GM1组，后期同control组处理。小鼠在急性低压氧处理24 h后应用免疫荧光和Western blot检测MMP9蛋白表达水平，通过湿重比和伊文思蓝定量评价脑水肿程度。结果GM1降低急性低压氧24 h后血脑屏障损伤，减少湿重比(Plt;0.05)和伊文思蓝渗出量(Plt;0.05)，并抑制MMP9表达上调(Plt;0.05)，减弱星形胶质细胞MMP9荧光强度。结论GM1抑制MMP9表达上调，可能参与其预防急性低压氧脑水肿的机制中。

单唾液酸神经节苷脂; 基质金属蛋白酶9; 急性低压氧

高原脑水肿(high altitude cerebral edema, HACE)是机体近期抵达高原后，在低压氧环境下迅速出现的一种特殊的急性重症高原病[1]。目前多数学者认为HACE主要是血管源性脑水肿,其发生、发展及预后与血脑屏障通透性迅速变化密切相关[2]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一类能降解细胞外基质成分的蛋白水解酶，MMP9是其中的主要成员。低氧应急环境下，MMP9通过降解细胞外基质引发血脑屏障通透性增加，在脑水肿发展过程中扮演着重要角色[3,4]。

外源性神经节苷脂神作为临床一线药现广泛应用于神经退行性病变、中枢神经系统损伤中。可自由穿过血脑屏障(blood brain barrier, BBB)，整合于神经细胞膜上，通过增强神经营养因子作用，维持线粒体结构稳定、减少自由基、降低兴奋性氨基酸毒性等作用参与神经保护[5]。前期研究证实单唾液酸神经节苷脂(monosialotetrahexosylganglioside, GM1)在多种神经损伤模型中通过抑制MMP9表达，维持血脑屏障完整性性来减轻脑水肿[6]。但是GM1能否通过抑制MMP9上调，减轻低压氧脑水肿还不清楚。

因此，本研究拟探讨GM1预防用药对急性低压氧脑损伤后MMP9表达变化，从而探索MMP9在GM1预防低压氧脑水肿中的潜在作用。

材料与方法

一、动物实验

1.时间点选择实验：健康成年雄性C57BL/6小鼠24只，质量22～25 g，第四军医大学实验动物中心提供。按随机数字表法分为四组(n=6)，分别为对照组、低压低频6 h组、低压低氧12 h组、低压低氧24 h组，对照组置于低压氧舱外常氧舱中，并于24 h后断头取脑。低压低氧6 h组、低压低氧12 h组、低压低氧72 h组分别置于低压氧舱中处理6 h、12 h、24 h后断头取脑后，通过Western blot检测MMP9蛋白表达。实验结果示低压低氧24 h组MMP9表达量明显增加(图1)，故取此时间点进行下步实验。

2.GM1预防急性低压氧脑水肿效果评价：健康成年雄性C57BL/6小鼠24只，质量22～25 g，第四军医大学实验动物中心提供，按随机数字表法分为四组(n=6)，分别为对照组、急性低压氧组、神经节苷脂治疗组、单纯给药组。通过伊文思蓝定量和湿重比评价BBB通透性，通过Western blot和免疫荧光检测MMP9表达。

二、急性低压氧模型建立

C57BL/6小鼠置于密闭低压氧舱(风雷，中国)后以50 m/s上升速度在5 min内达到模拟6 000 m海拔(350 mmHg，6%～7% O2)；低压氧舱内湿度维持在40%～50%，温度控制在22～24℃；小鼠在低压氧舱中自由饮水、摄食，光暗周期控制在24 h。

三、主要试剂

GM1(TRB公司, 阿根廷)兔抗小鼠MMP9(Abcam公司, 美国)，兔抗小鼠β-Tubulin(康为试剂, 中国)，山羊抗兔辣根过氧化物酶二抗(科昊生物, 中国)，山羊抗小鼠星形胶质细胞抗体(glial fibrillary acidic protein, GFAP)(Santa公司, 美国)，兔抗山羊、小鼠抗兔荧光二抗(Millipore公司, 美国)，伊文思蓝染料(恒远, 中国)，BCA法蛋白浓度检测试剂盒(碧云天, 中国)。

四、观察指标和检测方法

1.蛋白检测：使用Western blot方法检测脑组织MMP9蛋白含量。小鼠急性低压氧24 h后4%水合氯醛麻醉后端头取脑，脑组织称重后置于裂解液中溶解30 min，4℃ 16 000 r/min离心5 min，提取上清后定量，加入蛋白上样缓冲液95℃进行变性。相同蛋白量(30 μg/孔)加入10%聚丙烯酰氨凝胶电泳胶中电泳后转膜，5%牛奶室温封闭1 h后加入MMP9(1 ∶1 000)，β-Tubulin(1 ∶1 500)一抗，4℃摇床过夜。洗涤10 min×3次，然后加入山羊抗兔二抗(1 ∶10 000)，室温孵育2 h。再次洗涤10 min×3次，每条带加入200 μl显影液进行发光，Image J软件灰度值测定，以β-Tubulin为内参，计算MMP9条带与其的灰度值比值。

2.免疫荧光检测：急性低压氧处理24 h后立刻深度麻醉，暴露心脏，自心尖部插入灌注针至升主动脉，剪开右心耳，快速推入20 ml生理盐水，冲洗干净血液后，换入100 ml含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)进行快速固定，然后慢滴250 ml上述相同液体，灌毕后立即断头取脑，标本放入含20%、30%蔗糖的PBS液内梯度脱水，进行冰冻切片。自视交叉每隔5张切片取一张切片，厚度为10 μm，贴于明胶处理过的载玻片上。冰冻切片复温并晾干，画圈笔标记， 1% Triton X-100的PBS洗片，5 min×3次，甩干，每片加入20 μl MMP9及GFAP抗体的混合抗体，4℃孵育24 h后，PBS 5 min×3次，加入荧光二抗，室温孵育2 h，甘油封片，荧光显微镜下观察(Olympus,日本)。

3.脑组织含水量检测：采用脱颈椎法处死小鼠后，小心游离、取出整个大脑，去除小脑及脑干。用滤纸小心擦拭脑组织表面血迹后，在精密电子天平上迅速称量并记录组织块湿重。然后在 70℃干燥箱中烘烤，72 h后称量干重，达恒重后(两次称量干重误差小于0.002 g)记录组织块干重。按Elliot公式计算脑组织含水百分比。 Elliot 公式：WC(%)=(湿重一干重)/湿重×100%。

4.伊文思蓝(Evans blue, EB)含量的测定：小鼠在急性低压氧处理24 h后立即用 腹腔注射4%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，经尾静脉注入 2% EB 生理盐水溶液(4 ml/ kg)1 h 后，开胸通过左心室灌注生理盐水 ,直到右心房流出无色液体为止，断头取脑。样品称重并置入1.5 ml 50 %三氯乙酸溶液中。匀浆和离心(10 000 r/min , 20 min)后取上清液,四倍稀释于无水乙醇中。荧光值通过荧光分光光度计检测。根据光密度数值,从标准曲线上算出脑组织中 EB 含量，根据公式计算出 EB 含量：脑组织 EB 含量(ng/g湿脑组织)=标准品 EB 含量(ng/ml)×50 %三氯乙酸量(ml)/脑湿重(g)。

五、 统计学分析

分析采用SPSS 18.0统计学软件进行分析，对计量资料使用mean±SD进行表示，计数资料则使用中位数±四分位间距表示。使用单因素方差分析法，即one-way ANOVA进行差异性统计，使用Tukey检验进行组间检验、校正。所有数据比较，Plt;0.05认为有统计学差异。

结 果

一、急性低压氧24 h后MMP9表达上调

急性低压氧6 h即出现MMP9蛋白表达上调，至24 h表达明显高于control组(Plt;0.05, 图1)。

二、GM1抑制急性低压氧后MMP9表达上调

提前给予GM1处理，可以有效抑制急性低压氧后MMP9表达上调(Plt;0.05, 图2)。

三、GM1减弱星形胶质细胞MMP9免疫荧光强度

图3为MMP9与星形胶质细胞标志物GFAP的双标免疫荧光，红色为MMP9，绿色为星形胶质细胞标志物GFAP，黄色为二者共表达。结果显示，与对照组相比，GM1组MMP9免疫荧光强度无明显改变，低压低氧组MMP9免疫荧光增强，且MMP9/GFAP共表达增加；与低压低氧组相比，GM1+低压低氧组显著降低MMP9荧光强度，减少MMP9与星形胶质细胞标记物重叠。

图1 对照组、低压低氧6 h组、低压低氧12 h组及低压低氧24 h组MMP9蛋白表达
Fig 1 The protein expression of MMP9 in control group, HH 6 h group, HH 12 h group and HH 24 h group.

aPlt;0.05,vscontrol group.

图2 对照组、低压低氧组及GM1+低压低氧组、GM1组MMP9蛋白表达
Fig 2 The protein expression of MMP9 in control, HH, GM1+HH and GM1 groups

aPlt;0.05,vscontrol group;bPlt;0.05,vsHH group.

图3 GM1对急性低压氧后星形胶质细胞MMP9免疫荧光强度的影响
Fig 3 GM1 decreased the number of MMP9 positive glial cells
A: No change of the number of MMP9 positive glial cells in control group; B: GM1 without HH did not change the number of MMP9 positive glial cells; C: HH increased the number of MMP9 positive glial cells; D: GM1 decreased the number of MMP9 positive glial cells.

Bars=20 μ.

图4 对照组、低压低氧组及GM1+低压低氧组、GM1组湿重比
Fig 4 The wet/dry in control , HH, GM1+HH and GM1 groups

aPlt;0.05,vscontrol group;bPlt;0.05,vsHH group.

图5 对照组、低压低氧组及GM1+低压低氧组、GM1组MMP9蛋白表达
Fig 5 The Evans blue extravasation in control, HH , GM1+HH and GM1 groups.

aPlt;0.05,vscontrol group;bPlt;0.05,vsHH group.

四、GM1降低急性低压氧BBB破坏，减轻脑水肿

血脑屏障的通透性主要通过湿重比(图4)和伊文思蓝定量(图5)评价。湿重比结果显示：与对照组相比，低压低氧组湿重比明显增加(Plt;0.05)；与低压低氧组相比，GM1+低压低氧组湿重比显著降低(Plt;0.05)。伊文思蓝定量显示：与对照组相比，低压低氧组伊文思蓝大量渗出(Plt;0.05)；与低压低氧组相比，GM1+低压低氧组伊文思蓝渗出明显减少(Plt;0.05)。

讨 论

本研究证实急性低压低氧24 h后，MMP9表达上调，提前给予GM1腹腔注射可抑制MMP9表达上调，减轻急性低压氧血脑屏障损破坏，减少伊文思蓝渗出量和脑含水量。表明提前给予GM1抑制MMP9表达上调，可能参与其预防急性低压氧后脑水肿的机制中。

HACE作为高原脑病的终末阶段，主要表现为严重头疼、呕吐、共济失调和进行性意识障碍。HACE可根据Lake Louise临床诊断标准分为两类：血管源性HACE是未经AMS过程，而伴有相关精神症状和共济失调；细胞毒性HACE是由急性高山病进一步发展而来，并伴有精神改变或者共济失调[7]。HACE 具有起病急、进展速度快、病程变化复杂、并发症多而重、治疗不及时预后差、病死率高等临床特点，已成为高原危重病中研究的热点和难点[8]。最近研究报道急性低压氧后神经营养因子等明显增加，给予一系列干预措施可通过上调神经营养因子表达，可减轻急性低压氧后脑损伤[9]。神经节苷脂主要分布在神经细胞膜上，在维持细胞结构稳定和修复神经细胞损伤中发挥着重要作用。外源性单唾液酸四己糖神经节苷脂钠可自由通过BBB，整合于神经细胞膜上，并通过激活神经营养因子下游保护通路，发挥神经保护作用[10,11]。前期研究表明，持续给予大剂量GM1可有效减轻神经系统损伤后脑水肿[12]。本研究首次证实GM1通过保护BBB完整性有效预防急性低压氧脑水肿。

BBB由脑毛细血管内皮细胞及其间的紧密连接、基膜、周细胞与星形胶质细胞的终足组成。其中内皮细胞和紧密连接是维持血脑屏障功能的关键结构。急性低压氧环境下，一系列调节因子可影响内皮细胞的转运系统和酶系统，从而改变了血脑屏障的通透性[13]。MMP9是MMPs家族中明胶酶的一种，目前研究发现MMP9参与多种神经系统疾病的发生发展。近年来，研究认为MMP9与在早期脑水肿发生关系密切，但其具体机制目前尚不清楚。Guo等研究指出MMP9可能通过降解层粘连蛋白参与早期脑脑水肿[14]。Feiler等报道称MMP9通过促进脑水肿形成，进而促进后早期脑损伤的发展[15]。本实验结果显示，急性低压氧处理24 h后小鼠MMP9表达显著增加，提前给予GM1有效抑制MMP9表达上调。这一结果证实了MMP9可能参与了GM1预防急性低压氧脑水肿。

综上所述，本研究证实提前给予GM1可通过抑制MMP9上调，减轻急性低压氧脑水肿，表明下调MMP9可能是其脑保护的机制。

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EffectofgangliosideGM1onexpressionofMMP9afteracutehypobariccerebraledema

LIHu1,2,LIUHong1,2,WANGBairen3,GONGGu1

1DepartmentofAnesthesiology，GeneralHospitalofChengduMilitaryCommand,Chengdu610083;2DepartmentofAnesthesiology,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000;3DepartmentofNeuroimmunomodulation,InstituteofNeuroscienceofPLA,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

ObjectiveThe effect of monosialotetrahexosylganglioside (GM1) on expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP9) after acute exposure to hypoxia and hypobaric conditions was investigated.MethodsAdult male C57 mice were randomly divided into 4 groups (control, HH, GM1+HH, GM1,n=6). Mice in control group were kept under normal atmospheric pressure; mice in HH group were placed in a decompression chamber which simulated the environment of an altitude of 6 000 m ; mice in HH+GM1 group were exposed to acute hypoxia hypobaric after intra-peritoneal administration of GM1 (30 mg/kg/d) for 3 d; mice in GM1 group were kept outside the decompression chamber after intra-peritoneal administration of GM1 (30 mg/kg/d) for 3 d. The expression of MMP9 was analyzed by Western blot and immunofluorescence staining 24 h after acute hypoxia hypobaric. The integrity of the BBB was evaluated by using Evans blue extravasation and wet/dry ratio methods.ResultsAt 24 h after hypoxia hypobaric, the expression of MMP9 in HH group was increased (Plt;0.05), and in GM1+HH group MMP9 level was down-regulated compared with HH group (Plt;0.05). GM1 reduced the Evans blue extravasation (Plt;0.05) and wet/dry ratio (Plt;0.05).ConclusionGM1 plays a significant neuroprotection by suppressing expression of MMP9 after acute hypoxia hypobaric exposure.

Ganglioside GM1; Matrix metalloproteinase-9; Acute hypoxia hypobaric

1671-2897(2016)15-042-04

R 322.61

A

国家自然科学基金资助项目(0670666)

李虎，硕士研究生，E-mail: 418837376@qq.com

*通讯作者：巩固，副主任医师，硕士生导师，E-mail: gonggu68@163.com

2015-05-23；

2015-07-30)