HPLC法测定黄丹兰颗粒剂中苦参碱和氧化苦参碱含量

陈妍，邢正英，李继彬，李晗，房志仲

（1.天津医科大学药学院药剂学教研室，天津市临床药物关键技术重点实验室，天津300070；2.天津海滨人民医院药剂科，天津300280）

论著

HPLC法测定黄丹兰颗粒剂中苦参碱和氧化苦参碱含量

陈妍1，2，邢正英1，李继彬1，李晗1，房志仲1

（1.天津医科大学药学院药剂学教研室，天津市临床药物关键技术重点实验室，天津300070；2.天津海滨人民医院药剂科，天津300280）

目的：建立高效液相色谱（H PLC）法测定黄丹兰颗粒剂中苦参碱和氧化苦参碱含量的方法。方法：采用HPLC法以苦参碱、氧化苦参碱标准品为对照品，黄丹兰颗粒剂为样品，使用TIANHE®Kromasil C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为磷酸盐缓冲液（pH=3.0）-甲醇（93∶7），流速为0.8 mL/min，柱温为35℃，检测波长为220 nm，进样量为20 μL。结果：苦参碱回归方程为Y=40 074.09X-14.73，其进样浓度在2.5～25 μg/mL范围内呈良好线性关系（r=0.999 9，n=3），平均加样回收率为99.99%，RSD=0.057 7%（n=6）；氧化苦参碱回归方程为Y=53 380.27X+46.35，其进样浓度在2.0～20.0 μg/mL范围内呈线性关系（r=0.999 9，n=3），平均加样回收率为99.78%，RSD=0.443 2%（n=6）。苦参碱和氧化苦参碱平均含量分别为0.505 6 mg/g和0.306 7 mg/g，RSD分别为0.298 7%和0.154 2%。结论：HPLC方法分离效果好、专属性强、简便、灵敏和准确，可作为黄丹兰颗粒剂中苦参碱和氧化苦参碱含量的测定方法。

黄丹兰颗粒剂；苦参碱；氧化苦参碱；高效液相色谱法

黄丹兰颗粒剂是由苦参、黄芪、丹参、三七总苷、螺旋藻、绞股兰总皂甙和蝙蝠蛾孢菌丝体粉等组成，具有调节免疫功能，逆转纤维化进程，溶解纤维斑块的功效。苦参中主要活性成分为苦参碱和氧化苦参碱。近年来研究发现，其具有抗炎、抗菌、抗病毒、抑制免疫、抗纤维化、抗肿瘤等生物学作用［1-3］。在动物实验中，对肝纤维化、肺纤维化及溶解纤维斑块等具有很好的治疗效果。中药苦参是黄丹兰颗粒剂处方中的主药，为了有效控制产品的质量，参考相关文献［4-9］采用HPLC法测定了该颗粒剂中苦参碱和氧化苦参碱的含量，建立该制剂的质量控制标准，为申报医院制剂提供理论依据。

1　材料和方法

1.1仪器美国高效液相色谱仪（Spectra-physics），输液泵（SP8810 precision isocratic，BIO-RAD），检测器（Spectra 100 variable wavelength detector），Anastar色谱工作站，TIANHE®Kromasil C18色谱柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），KQ-100B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），ALC-210.4电子分析天平（ACCULAB Sartorius group，北京赛多利斯仪器系统有限公司），pH计（雷磁pHs-25型，上海精密科学仪器有限公司）。

1.2药品与试剂苦参碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号为110805-200306，供含量测定用）和氧化苦参碱对照品（中国药品生物质品检定所，批号为110780-200506，供含量测定用）；黄丹兰颗粒剂（本室自制3批，批号：141014、141018和141022）；甲醇（天津市康科德科技有限公司，色谱纯）；乙腈（天津市康科德科技有限公司，色谱纯）；其它试剂均为市售分析纯；重蒸水（自制）。

1.3色谱条件与系统适用性试验色谱柱：TIANHE®Kromasil C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为磷酸盐缓冲液（磷酸调节pH=3.0）-甲醇（93∶7）；流速为0.8 mL/min；检测波长为220 nm；柱温为35℃；进样量20 μL。

1.4样品溶液的制备

1.4.1对照品溶液的制备精密称取苦参碱对照品12.5 mg、氧化苦参碱对照品10 mg，分别置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，密塞。精密量取上述溶液各10 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，密塞，制备成50 μg/mL的苦参碱对照品储备液和40 μg/mL的氧化苦参碱对照品储备液，备用。

1.4.2供试品溶液的制备取黄丹兰颗粒剂至乳钵中研细，取粉末1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入浓氨水1 mL，CHCl350 mL，密塞，摇匀，精密称定质量，放置4 h，随时振摇，超声提取20 min，再精密称定质量，用CHCl3补足其减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，回收溶剂至干，立即取下，残渣加甲醇1 mL使其溶解，定量转移至10 mL量瓶中，加磷酸盐缓冲液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.4.3阴性样品对照液的制备按处方比例，取除苦参外的其余药味，按工艺要求制成不含苦参的阴性样品，再按“1.4.2项下”中的方法制成阴性样品对照液。

2　结果

2.1专属性试验精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品对照液各20 μL，按照“1.3”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。苦参碱和氧化苦参碱对照品的保留时间分别为9.7和12.3 min左右，供试品色谱行为与苦参碱和氧化苦参碱对照品色谱峰相应的位置上有相应的色谱峰，阴性对照对测定结果无干扰，色谱见图1。

图1　黄丹兰颗粒剂中苦参碱和氧化苦参碱色谱

2.2线性关系考察

2.2.1苦参碱精密量取苦参碱对照品储备液，配制成2.5、5、10、15、20和25 μg/mL系列对照品溶液。精密量取上述标准溶液20 μL注入液相色谱仪测定，记录色谱图。以峰面积（Y）对苦参碱浓度（X）进行线性回归，得回归方程Y=40 074.09X－14.73（r=0.999 9，n=3），结果表明：苦参碱进样量在2.5～25 μg/mL范围内，呈良好线性关系。

2.2.2氧化苦参碱精密量取氧化苦参碱对照品储备液，配制成2.0、4.0、8.0、10.0、15和20 μg/mL系列对照品溶液。精密量取上述标准溶液20 μL注入液相色谱仪测定，记录色谱图。以峰面积（Y）对苦参碱浓度（X）进行线性回归，得回归方程Y= 53 380.27X＋46 035（r=0.999 9，n=3），结果表明：氧化苦参碱进样量在2.0～20.0 μg/mL范围内，呈线性关系。

2.3稳定性试验精密吸取供试品溶液20 μL，在0、2、4、6、8及12 h测定苦参碱和氧化苦参碱峰面积值，结果苦参碱的RSD为1.510 5%，氧化苦参碱RSD为0.991 3%（n=6），表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.4精密度试验精密吸取供试品溶液20 μL，按上述色谱条件，连续测定6次，结果其中苦参碱RSD为1.050 7%，氧化苦参碱RSD为0.227 5%（n=6），表明仪器的精密度良好。

2.5重复性试验按“1.4.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别取20 μL进样测定，结果苦参碱和氧化苦参碱的含量分别为0.504 2，0.306 9 mg/g，RSD分别为0.217 8%，0.703 8%（n=6），表明本法的重复性良好。

2.6回收率试验

2.6.1苦参碱精密称取已知含量的样品，精密加入不同量的苦参碱对照品，按供试品溶液的制备方法制得待测液，测定含量，平均回收率为99.99%，RSD为0.057 7%，见表1。

表1　苦参碱回收率试验结果

2.6.2氧化苦参碱精密称取已知含量的样品，精密加入不同量的氧化苦参碱对照品，按供试品溶液的制备方法制得待测液，测定含量，平均回收率为99.78%，RSD为0.443 2%，见表2。

表2　氧化苦参碱回收率试验结果

2.7样品测定按上述色谱条件和含量测定方法，精密测定3批样品，记录峰面积，计算含量。苦参碱平均含量为0.505 6 mg/g，氧化苦参碱平均含量0.306 7 mg/g，见表3。

表3　样品含量测定结果

3　讨论

3.1流动相的选择分别考察3种不同比例的流动相：（1）乙腈-0.1%KH2PO4溶液；（2）乙腈-水（含KH2PO4和庚烷磺酸钠）；（3）磷酸盐缓冲液（pH=3.0）-甲醇（93∶7）。结果表明：使用流动相为磷酸盐缓冲液（pH=3.0）-甲醇（93∶7），流速为0.8 mL/min，柱温为35℃时，色谱峰对称，基线平稳，分离效果最好。

3.2供试品提取纯化条件的选择根据苦参碱和氧化苦参碱的溶解性能，并参考有关文献［4-9］的提取纯化方法，最终选取如下方法：取黄丹兰颗粒剂至乳钵中研细，置具塞锥形瓶中，加入浓氨水使样品充分润湿，加入CHCl3，密塞，摇匀，放置4 h，随时振摇，超声提取20 min，滤过。超声的方法比回流法更为简便。

3.3薄层层析试验薄层色谱（TLC）分析在药物制剂等快速检测中具有独特的优势，简便易行，可以作为定量分析初始依据。在建立HPLC定量分析中，同时利用“1.4项下”的样品溶液进行了TLC试验，硅胶G加2%NaOH溶液的自制板，展开剂为氯仿∶甲醇∶浓氨溶液（5∶0.6∶0.3），上行展开8 cm，显色剂为依次喷以稀碘化铋钾试液和亚硝酸钠试液，日光下苦参碱和氧化苦参碱显红棕色斑点，阴性对照液无干扰［8-11］，结果显示TLC分析可以作为该制剂的定性分析方法。

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（2016-02-02收稿）

R927.2

A

1006-8147（2016）05-0452-03

陈妍（1983-），女，主管药师，硕士在读，研究方向：临床药学；通信作者：房志仲，E-mail：fangzhizhong@tm u.edu.cn。