一体式微弱荧光检测器的研究与设计*

姚定勇，蔡　强*，沈国金，王振华

（1.杭州电子科技大学电子信息学院，杭州310018；2.浙江清华长三角研究院，浙江嘉兴314006）

一体式微弱荧光检测器的研究与设计*

姚定勇1，2，蔡强1，2*，沈国金2，王振华2

（1.杭州电子科技大学电子信息学院，杭州310018；2.浙江清华长三角研究院，浙江嘉兴314006）

设计完成了一体式微弱荧光检测器，该检测器可以检测经激发光照射后荧光染料、绿色荧光蛋白等物质发出的微弱荧光信号，由此测得荧光素、绿色荧光蛋白等物质的含量。检测器由光源模块、PN放大模块、采样控制模块和通讯模块组成。应用测试结果表明该检测器能检测1 000个光子的微弱荧光强度变化，精度上可检测3.0 pmol的荧光素，满足一般的微弱荧光检测需求。

光电检测；一体式；荧光分析；跨阻放大电路；积分放大电路

荧光分析是定性或定量分析物质特性的重要方法，具有灵敏度高，信号稳定等优点［1］。荧光分析法能够提供荧光强度、荧光效率以及荧光寿命等重要参数信息［2］，广泛应用于工业分析、环境保护、医药、生物等领域。对于很多样本量或样本体积较小的情况下，荧光强度较低，因此微弱荧光检测具有重要意义。

微弱荧光检测主要采用光电二极管或光电倍增管作为探测器。微弱荧光的检测方法有两类，一类是直接检测法，另一类是基于互相关等数学原理的检测法，如锁相放大器［3］，取样积分器［4］。直接检测法原理简单，信噪比相对低，不受信号类型限制，容易调试，是目前最常用的微弱荧光检测法；而锁相放大器和取样积分器，输出信噪比高，会受信号类型限制，锁相放大器适用于单频和窄带弱信号检测，而取样积分器适合检测复杂的宽带周期信号，且难以调试。目前，商用的荧光检测器有岛津ShimadzuRF-20A，沃特斯2475等，这些荧光检测器通常结构复杂，体积较大，不适合紧凑的仪器结构设计。因此，本文设计一体式微弱荧光检测器模块，为使模块体积小，且易于调试，采用LED作为激发光源，使用直接检测法，利用光电二极管结合放大、滤波等电路检测微弱荧光信号，具有体积小，易于集成，适用范围广的特点。

1　整体结构设计

本文设计的荧光检测器是光学分析仪器的组成部分，因此要求该检测器需具备模块化，可集成，可控制，输出数字信号的特点。考虑到光学分析仪器典型应用领域，如生物样品测定［5］等。本文设计的一体式微弱荧光检测器要求精度达到3.0 pmol的荧光素，检测波长范围为400 nm～750 nm，包括光路结构和电路结构两部分。

1.1光路结构

检测器光路结构如图1所示。由光源模块输出的激发光入射到样品孔后，激发荧光信号进入荧光检测光路中，检测光路分为激发光路和发射光路两部分。激发光路是将光源发射的单色光照射到样品上，实现荧光激发。检测光路采用滤光片组加光电二极管的方案，其中滤光片组用于选择不同的激发波长，而光电二极管能检测微弱荧光信号的同时利用其体积小的特点，可缩短光路尺寸大小［5］，本设计选用滨松的S2387-66R型光电二极管。为了适应不同场合的需求，光路结构设计成插件形式，需根据检测样本的激发波长和发射波长选择合适的LED和滤光片组，实物如图2。以实验中检测荧光染料Cy3为例，激发波长为525 nm，荧光发射波长为590 nm。光源选用Thorlabs公司的LED525E型LED（规格：T 1-3/4），激发滤光片和发射滤光片分别为汇博光学的EF525-45（规格：D12×2 mm）和EF595-60（规格：D12×6 mm）型滤光片，二向色镜为汇博光学DM560（规格：16×15×1 mm）型色镜。

图1　光路结构图

图2　荧光检测器实物照片

1.2电路结构

检测器采用低噪声前置放大电路调理光电二极管输出的光电流，隔离信号源与后级放大电路之间的耦合作用［6］。采用二级放大和滤波电路提高信号强度，抑制噪声。考虑到微弱荧光的激发光源易受温度等外界因素干扰，因此本文采用反馈型光源驱动电路，用光电二极管配合低噪声光电检测电路和信号调理电路，反馈控制光源驱动电流的的检测。实现激发光强的稳定。电路结构组成如图3所示。

图3　电路结构图

2　检测电路设计

本文在检测电路上采用了两种方案：跨阻型检测和积分型检测。其中跨阻型放大器的检测方案不受积分时间限制，因而检测速度快，但灵敏度稍低，适用于检测速度快，但灵敏度要求不高的场合；积分型因积分特性可以灵活控制检测器的灵敏度，但不适合用在检测速度要求高的场合。

2.1跨阻式检测电路

2.1.1光电转换电路

本设计使用日本滨松的S2387-66R型硅光电二极管作为探测器。用光电二极管组成的光电检测电路，实际上是一个光→电流→电压的变换器［7］。S2387-66R型光电二极管的灵敏度在光波长为560 nm时典型值为0.33 A/W，暗电流最大50 pA，可以检测nW级微光功率。考虑到在微弱光强信号测量中，暗电流带来的噪声非常明显［8］，本设计采用零偏置工作的光伏模式，应用于频率不高的微弱光信号检测［9，10］，电路如图4所示。根据电路，输出电压为：

式中：S为光电二极管的灵敏度，P为入射光功率，入射光功率为nW量级甚至更低，Rf为数百kΩ到数十MΩ，输出电压Vo为几mV到几十mV。本设计为尽可能提取微弱荧光信号，反馈电阻大小选择10 MΩ。电路中Cf用于防止电路自激振荡，以保证电路能够工作在良好的线性条件下［11］。

图4　光电转换电路

在微弱光信号检测电路中，输入光功率一般在0到几十nW之间，根据所选光电池的灵敏度，输出电流最多只有几十nA。本设计选择AD8667做为前级放大电路的运放，其典型的输入偏置电流为0.3 pA，输入失调电压为30 μV，该运放输入偏置电流比输入信号小4个数量级，可以达到较好的信噪比［11］。放大器的输入失调电压是微伏级，低于目标输出电压3个数量级，满足使用要求。

图5为光电二极管等效电路，输入偏置电流Is经I/V转换后得到的输出为IB·Rf，输入失调电压经运放后输出为（1+Rf/Rs）/VB。AD8667的典型输入偏置电流0.3 pA，输入失调电压为30 μV，光电二极管的并联电阻 Rs典型值为 10 GΩ，反馈电阻Rf为 10 MΩ，因而，输入偏置电流和输入失调电压对输出电压的影响为几十μV，当输入光功率在nW级的时候，这种影响可以忽略不计。

图5　光电二极管等效电路

2.1.2滤波电路

为了提高电路的信噪比，本设计在光电转换电路后加入二阶有源低通滤波器［12］，以滤除有用信号频带外的噪声。光电二极管经光电转换后得到的是直流信号，噪声主要来源于开关电源。因此，这里只要用低通滤波器滤除开关电源中引入的噪声信号即可，放大器选用AD8667。

滤波电路如图6所示，传递函数

由于实验中使用的开关频率为100 kHz，为有效滤除开关噪声，设置滤波器截止频率为1 kHz，令R8=R9=15 kΩ，C16=C17=10 nF，得fH=1.061 kHz。

图6　滤波电路

2.1.3放大电路

一级放大电路难以实现对微弱信号的放大，再加上放大器本身增益有限，而且信号还淹没在噪声中，输入信噪比非常低，所以须采用多级放大电路来实现信号的放大处理［13］。电路如图7所示，采用二级放大电路，二级放大电路与后端AD转换电路结合可以实现简单的程控放大。利用AD转换芯片对两级放大的输出分别采样，根据信号幅度取舍信号。这种方式不仅能够实现程控放大，还可以简化电路结构。本设计采用OP2177作为主放大电路的放大器，其中

图7　主放大电路

2.2积分式检测电路

本设计使用TI公司的IVC102积分放大电路进行微弱光功率的测量，电路如图8所示。

图8IVC102积分电路

IVC102是一种采用积分方式的放大器，内部集成了100 pF的积分电容。具有积分时间可调，噪声低，响应速度快的几大特点。IVC102的积分输出为：

其中CINT是积分电容，积分电路的输出实际只与IIN（t）有关。IIN（t）=IS（t）+IN（t），IS（t）光电池产生的电流；IN（t）为噪声电流，主要来源是放大器的输入偏置电流以及输入噪声电流。光电二极管产生的信号是直流信号，由此可以得到

式中，TINT为积分时间，从公式可知，积分输出的趋势呈线性，积分的结果是以牺牲时间为代价换取检测灵敏度。IVC102对于输入信号频率大于1/TINT的频率响应为-20 dB/dec。因此，对于高频信号而言不适合采用该芯片，而本设计的光电二级光输出为直流信号，故适合使用。为增加检测范围，采取分段积分的方法，信号较弱时，设置积分时间200 ms，信号较强时，设置积分时间为20 ms。

3　光源驱动电路设计

在光电检测电路中，除系统本身产生的噪声，包括光电检测器件以及检测电路的固有噪声会影响检测结果的稳定性，外部噪声包括光辐射源的随机波动和附加的光调制、光路传输介质的湍流和背景起伏、杂散光的入射以及检测系统所受到的电磁干扰等也会影响检测结果的稳定性［14］。因此，本设计除通过遮光和加滤光片来减小外部噪声，还增加了一个带光强反馈的驱动电路，稳定辐射光源功率，减小外部噪声干扰。

光源驱动电路采用ADI公司的ADN2830集成电路构成，电路如图9所示。ADN2830是带有光强反馈功能的光源驱动器。输出电流范围在4 mA到200 mA。使用时需要外接反馈光电二极管，控制回路通过调节驱动发光二极管的电流大小来保持反馈光电二极管的恒定电流，从而使得发光二极管的光功率恒定。光功率的大小在硬件电路上调节。支持可编程报警机制，可软件控制光源驱动器。并提供两种驱动模式：恒定光功率模式和恒流源模式。恒流源模式可使发光二极管电流恒定，但无法保证光源的稳定，因此这里采用恒定光功率的模式。

图9　光源驱动电路

4　信号采集电路设计

为直观读取微弱光检测电路的输出结果，需要经过数据的采集和显示环节［15］。信号采集电路采用TI公司的ADS1254芯片，它是24 bit高精度串行模数转换器，运用逐次逼近的原理，四通道输入，模拟电压的输入范围为±10 V，采样速率可通过外部时钟调节，最大采样频率20 kHz，采用SPI通信方式。采样电路示意图如图10所示，利用STM32作为数据采集与传输核心，MAX3232是数据传输的桥梁。采样频率由CLK决定，本设计采用STM32输出2 M的PWM波作为采样时钟，采样速率5 kHz，输出24 bitAD数据。STM32单片机接收采样指令后进行采样，然后以指令形式返回采样结果。

图10　信号采集电路示意图

5　通信协议设计

通信协议设计是基于Modbus-RTU协议的下发指令和上传数据，数据通信采用主从查询模式，数据校验使用Modbus CRC校验。本设计使用Modbus协议中的03功能，即读单个或多路寄存器。接收、发送指令的格式与具体指令如表1所示。

表1　通信协议格式

6　应用测试

为测试一体式荧光检测器，本文以生物荧光分析领域的典型应用为背景，建立测试方法，优化设计方案。测试方法采用荧光染料Cy3，采用标准缓冲液稀释法配置不同浓度待测溶液，用Thorlabs公司的LED525E型中心波长为525 nm的LED激发荧光染料。并用单光子计数器的测试结果作为标准参照。图11是测试装置。测试方法是将微弱光检测模块挂载在托盘上方，将待测样品加在96孔微孔板中，通过主控板控制步进电机的精准走位，使检测模块的激发光对准样品孔，荧光染料经激发后发射微弱荧光信号被位于孔正上方的检测器检测，再被主控板读取并传送至上位机显示。检测时装置外壳是完全封闭的，避免受外界光干扰。

图11　测试装置

测试数据如表2所示，分别列出了单光子计数器的检测结果和荧光检测器的检测结果，表中给出了荧光染料中荧光素的含量，以光子的变化量作为光强变化的依据，与检测结果做对比。

表2　一体式荧光检测器检测结果

从前述方案设计和检测结果可以看出：（1）两种方案的检测器精度均可以达到3.0 pmol的荧光素，可以满足一般微弱荧光的检测。通过对样本的重复测试得出两种方法随机误差均小于8%，积分型检测器的检出限为2.9 pmol荧光素，线性度为99.02%；跨阻型检测器的检出限为12.7 pmol荧光素，线性度为99.5%，积分型和跨阻型检测器测量范围均不超过6.0 nmol荧光素。（2）积分型检测器的灵敏度更高，但牺牲了检测时间。（3）积分型检测器电路结构简单，但采用IVC102作为积分器其频率特性使其只适合检测低频微弱荧光信号；跨阻型检测器电路复杂，但可通过调整滤波器频率满足多数微弱荧光信号的检测需求。

7　结论

本文依据市场上现有荧光检测器的不足，结合微弱荧光检测的需求，设了一体式微弱荧光检测器。并根据检测速度和灵敏度要求的不同，给出了两种方案，实验结果表明两种方案均可用于检测荧光分析法中的微弱荧光信号。其模块化的特点也为相关仪器的集成提供了极大的方便。

［1］王永利，张江伟，王立华，等.荧光分析法在药物分析中的应用研究进展［J］.中国实验方法学杂质，2011（12）：253-255.

［2］李双喜.荧光微弱信号检测电路设计［J］.电子工程师，2005，31（2）：52-54.

［3］聂娅琴，许雪梅，李奔荣，等.基于动态采样的锁相放大微弱信号检测［J］.传感技术学报，2013，26（9）：1243-1247.

［4］殷金坚.基于诱导荧光的黄曲霉毒素光谱检测系统的研制［D］.长春：吉林大学，2006：30-40.

［5］周鹏飞.多功能微孔板分析仪设计与实现［D］.杭州：杭州电子科技大学，2014：10-11.

［6］冀大雄，陈孝桢，刘健，等.一种低功耗微弱信号放大电路的优化设计与研究［J］.电子器件，2008，31（4）：1303-1306.

［7］杜习光.微弱光信号检测电路的设计［J］.电子元器件应用，2010，12（1）：52-54.

［8］龚涵，陈浩宇.微弱光信号检测电路的设计与实现［J］.机械与电子，2007，27：85-87.

［9］王蒙，刘嘉，闵力.微弱光信号检测电路的设计和噪声分析［J］.电子设计工程，2014，22（10）：134：136.

［10］李鹏，祝连庆，陈青山，等.微弱光信号的光电探测放大电路的设计［J］.电子元器件应用，2012，14（7）：26-32.

［11］李长青，梅欣丽，明奇.微弱光信号检测电路的实现［J］.应用光学，2010，31（5）：724：727.

［12］李远明，陈文涛.微弱光信号前置放大电路设计［J］.设计参考，2007，9（8）：51-53.

［13］梁培艳.微弱直流电压信号检测［D］.成都：电子科技大学，2013：43-45.

［14］王立刚，张殿元.低噪声光电检测电路的研究与设计［J］.电测与仪表，2007，44（8）：63-66.

［15］卢莉萍，李翰山.微弱光电信号的检测与采集［J］.西安工业大学学报，2011，31（4）：326-329.

姚定勇（1991-），男，汉族，安徽六安人，杭州电子科技大学在读硕士研究生，主要研究方向为环境检测仪器技术，嵌入式系统，479334246@qq.com；

蔡强（1972-），男，汉族，安徽蚌埠人，浙江清华长三角研究院分析测试中心研究员，主要研究方向为环境检测仪器技术研究，caiq@tsinghua.edu.cn。

Research and Design of the Integrated Detector for Weak Fluorescence Signal*

YAO Dingyong1，2，CAI Qiang1，2*，SHEN Guojin2，WANG Zhenhua2
（1.Electronic Information Institution of Hangzhou Dianzi University，Hangzhou 310018，China；2.Yangtze Delta Region Institute of Tsinghua University，Jiaxing Zhejiang 314006，China）

A integrated detector is designed and accomplished for weak fluorescence signals，aiming at the detection of the fluorescence intensity emitted by Fluorescent dyes，Green fluorescent protein or other material.The detector can be used to measure the concentration of the Fluorescent dyes，Green fluorescent protein or other material.The detector can be made up of several modules，which are the source of light，the amplifier of PN，sampling control unit and the communication unit.Application of the test results show that the detector can detect weak fluorescence intensity of 1 000 photons change，3.0 pmol Fluorescein.It can be used for general needs of weak fluorescence detection. Key words:photoelectric detection；integrated；fluorescence analysis；conventional transimpedance amplifier；integrating transimpedance amplifier

TP211.6

A

1005-9490（2016）05-1129-06

项目来源：国家重大科学仪器设备开发专项目（2012YQ15008705）；浙江省科技计划项目（2014F10059）

2015-10-10修改日期：2015-10-27

EEACC:425010.3969/j.issn.1005-9490.2016.05.022