乳酸菌与酵母菌混合发酵麦芽汁饮料工艺研究

刘仁禄 陶兴无 许晓梅 等

摘要：为了探讨乳酸菌与酵母菌在麦芽汁发酵饮料中的应用条件，试验比较了乳酸菌在乳酸细菌培养基和麦芽汁中的生长情况，探讨乳酸菌在麦芽汁中的产酸情况以及与酵母菌混合发酵的情况。正交试验结果表明，乳酸菌与酵母菌混合发酵麦芽汁工艺最佳条件为：12%麦芽汁中接种4%（V/V）酵母菌，28 ℃恒温发酵8 h后经64 ℃恒温水浴30 min灭活，再按2%（V/V）接种保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌组合（1∶1，体积比）菌种，37 ℃恒温发酵12 h，按此工艺方案所得发酵液经杀菌后离心澄清，色泽橙黄透亮，组织均匀，具有适宜的香味且酸味醇厚。

关键词：麦芽汁；乳酸菌；酵母菌；饮料

中图分类号：TS261.4；S512.3+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）04-0988-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.043

Study on the Mixed Application of Lactic Acid Bacteria and Yeast

in Fermentation Wort Beverage

LIU Ren-lu， TAO Xing-wu， XU Xiao-mei， YUE Yin， BIAN Meng

（College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China）

Abstract：The conditions of application of lactic acid bacteria and yeast in fermentation wort beverages were discussed. The growth situation of the lactic acid bacteria in wort and MRS medium was compared. Moreover，the lactic acid bacteria's acid production situation and mixed fermentation with yeast was studied. Based on the orthogonal experiment， the fermentation conditions were determined as follows： inoculated 4%（v/v） yeast in 12Bx wort， fermented for 8 h at 28 ℃ and then inactivated in 64 ℃ with 30 minutes， then inoculated 2%（v/v） mixed lactic acid bacteria， and fermented for 12 h at 37 ℃. Under the process， the color of the fermentation solution was orange and bright， which had a well-closed formation， endurance flavor and deep acidity.

Key words：wort；lactic acid bacteria；yeast；beverage

麦芽价格低廉，来源广泛，大量应用于啤酒酿造。麦芽经糖化制得的麦芽汁中，除了丰富的糖类物质和含氮化合物外，还含有大量的人体所需的微量元素，具有开胃、健脾、消滞、改善肠道功能等功效[1，2]，麦芽汁在发酵之前带有生味和不清爽的味道，通过微生物发酵可将异味除掉，所以麦芽也是生产功能性饮料的理想原料。与啤酒相比，麦芽汁乳酸菌饮料的营养价值更高，尤其是维生素含量更高[3，4]。

乳酸菌发酵产品在促进人体健康、治病防病方面发挥重要作用。乳酸菌在利用可发酵性碳水化合物的过程中，产生大量的乳酸以及一定量的乙酸、甲酸、丙酸等代谢产物，有较强的抗菌防腐作用[5，6]。随着乳酸菌发酵饮料研发的不断深入和对传统谷物开发利用的需求提升，乳酸菌饮料的原材料也从鲜乳及乳制品逐渐延伸到大米、小麦、大麦等谷物[7，8]。以麦芽汁为主要原料辅以蔬菜汁、果汁等进行乳酸菌发酵，国内外已经有部分研究，得到的发酵饮料具有独特的风味和良好的营养保健作用[9-15]。由于蔬菜汁、果汁的价格昂贵，来源有限，米乳、米汁等谷物类健康饮料也逐渐成为研究热点[16]。目前对谷物类尤其是全麦芽汁乳酸菌发酵饮料的研究还处在起步阶段，随着人们对高生活质量和养生保健的追求，开发麦芽汁发酵功能性饮料具有广阔的前景。本研究以麦芽汁为原料，探讨乳酸菌和酵母菌混合发酵的工艺条件，旨在为开发新型麦芽汁饮料提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器及设备

保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）3种乳酸菌均为武汉轻工大学生物工程实验室保藏菌种；酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）为安琪酵母股份有限公司生产啤酒高活性干酵母。

麦芽（澳洲二棱大麦芽）由武汉轻工大学啤酒发酵实验室提供。白砂糖及其他试剂等均为市售。

高速粉碎机，电子天平，高压灭菌锅，恒温水浴锅，恒温培养箱，低速离心机，净化工作台，721型分光光度计，光学显微镜，糖锤度计等。

1.2 方法

1.2.1 培养基的制备

1）麦芽汁。麦芽粉碎后，加4倍水调浆，53 ℃恒温水浴1 h再升温至63 ℃、保温约1 h，碘液检测至糖化完全。糖化液用多层纱布过滤至澄清，煮沸蒸发至浓度12%后，分装于洁净的容器中，于115 ℃灭菌30 min，备用。

2）乳酸细菌培养基（MRS）。蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，葡萄糖5.0 g，吐温80 1.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸二铵2.0 g，七水合硫酸镁0.2 g，一水合硫酸锰0.05 g，水1 000 mL，pH 6.5～6.8，于115 ℃灭菌30 min，备用。

1.2.2 发酵菌种的制备

1）酵母菌。麦芽汁是啤酒酵母的天然培养基，可直接用于菌种的扩大培养。取适量活性干酵母接入麦芽汁培养基中，于28 ℃、120 r/min摇床培养24 h，转接至新的麦芽汁培养基中继续培养，经3～4次传代与扩大培养后，制成种子液，放入冰箱中冷藏备用。

2）乳酸菌。将乳酸菌从MRS培养基转到麦芽汁中培养，需要经过适应驯化过程。将经过MRS培养基培养活化的乳酸菌逐步转入麦芽汁与MRS混合培养基（依次采用1∶4、2∶3、4∶1，体积比）中培养，最后再转入全麦芽汁培养基中，经3～4次传代与扩大培养，制成种子液，放入冰箱中冷藏备用[4]。

1.2.3 乳酸菌的生长、产酸试验 乳酸菌种子液或乳酸菌组合（两种和三种乳酸菌组合分别按1∶1和1∶1∶1，体积比）种子液按2%（V/V）接种量，分别接种至MRS培养基和12%麦芽汁中，37 ℃恒温培养，定时取样检测培养液的光密度值（OD600 nm值）和酸度值。

1.2.4 乳酸菌和酵母菌混合发酵麦芽汁试验 麦芽汁在选定条件下经过酵母菌发酵后，用白砂糖调整发酵液的浓度，按2%（V/V）接种量接种乳酸菌种子液，在一定条件下进行二次发酵。

1.2.5 检测方法 采用光电比浊法[17]，以未接种的培养基溶液作参比溶液[18]，在600 nm波长下测定光密度值（OD600 nm值）。按《GB 5413.34-2010》规定方法测定总酸（°T）。样品经过4 000 r/min离心10 min，取上层清液，用糖锤度计测定浓度。

1.2.6 发酵液感官评价方法 感官评价在实验室进行[19，20]。聘请20名品评师对离心澄清后的发酵液进行品评。根据香味、口感、色泽3个方面对样品进行感官评分，其中香味、口感各占40分，色泽占20分，总评得分为3项得分之和（满分为100分）。将20人评分的平均值作为最终结果。具体评分标准见表1。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌在麦芽汁和MRS培养基中的生长情况对比

MRS培养基是一种适合各种乳酸菌分离和培养的常用培养基。考虑到麦芽汁与MRS培养基营养成分之间的差异，本试验以MRS培养基作对照，探讨保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、植物乳杆菌等3种乳酸菌及其组合在麦芽汁基质中的生长情况。将驯化后的乳酸菌分别接种于MRS培养基和麦芽汁进行恒温培养，每隔2 h取样测定OD600 nm值，结果分别如图1至图6所示。由图1至图6可知，这3种乳酸菌及其组合在麦汁中的生长趋势与在MRS中的生长趋势一致，经过4～6 h后其在麦芽汁中的生长速度明显加快，进入对数生长期，在培养10～12 h后菌种开始进入生长稳定期；虽然在麦芽汁中生长速率较MRS相对缓慢，菌体生长量也不及在MRS培养基中的生长量，但都能基本适应麦芽汁基质。

2.2 乳酸菌在麦芽汁培养基中的产酸情况

乳酸菌的产酸能力是其代谢情况最重要的表现。将驯化后的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、植物乳杆菌等3种菌及其组合分别接种于麦芽汁进行恒温培养，每隔4 h取样测定酸度值，结果如图7所示。由图7可知，单一乳酸菌在麦芽汁中产酸速率差异较小；在4～16 h之间均保持较高的产酸速率，在16 h以后产酸速率减缓；24 h时的总产酸量上并无明显差异。两种或三种乳酸菌组合培养时，产酸速率均高于单一乳酸菌培养时的产酸速率，并且所有的组合产酸趋势基本一致，24 h时的总产酸量基本相同。从产酸能力来看，两种或三种乳酸菌组合比单一乳酸菌要强。

2.3 乳酸菌和酵母菌混合发酵麦芽汁试验

根据前期的试验结果，将麦芽汁用酵母菌发酵后，再用乳酸菌进行二次发酵，有利于除去麦芽汁的异味，赋予发酵液特殊香味和滋味。

2.3.1 酵母菌发酵温度和时间的选取 要去除麦芽汁的涩口感，同时不产生大量酒精，就需要控制酵母菌发酵的程度。在麦芽汁中以4%（V/V）的接种量接种活化后的啤酒酵母，分别在28、30、32 ℃条件下恒温发酵8 h，再对这3种温度条件下得到的发酵液分别进行感官品评，结果表明，它们之间差异并不显著。在麦芽汁中以4%（V/V）的接种量接种制备好的发酵菌种，于28 ℃恒温静置发酵，以发酵液感官评价来确定发酵时间。酵母菌发酵时间超过9 h后，发酵液中产生乙醇、双乙酰等酒类风味物质，对饮料感官质量产生不利影响。发酵时间低于6 h时，发酵液麦汁味浓，口感单一，生涩感明显，不适宜作为饮料。通过发酵液感官品评，最后选取酵母菌发酵温度28 ℃、发酵时间8 h进行下一步的试验。

2.3.2 正交试验 前期在对保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、植物乳杆菌等3种乳酸菌在麦芽汁中生长、产酸情况试验的同时，对发酵液进行了感官评价，结果显示植物乳杆菌无论是单独还是与其他菌株混合发酵，均会使发酵液带有一种涩口感，并且有明显的杂味。经过综合考虑后，下一步选用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌组合与啤酒酵母进行混合发酵麦芽汁正交试验。将经过28 ℃、8 h发酵的酵母发酵液，添加白砂糖至12%，再接种驯化后的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌组合（1∶1，体积比），以乳酸菌发酵时间、发酵温度和酵母发酵液是否灭活为3因素，采用L9（34）进行正交试验，试验因素与水平见表2。在设计正交试验因素水平（表2）时，对酵母发酵液进行加热灭活处理（灭活条件为64 ℃水浴，30 min）时考虑加热可停止酵母的继续生长代谢，并使酵母细胞在一定程度上自溶，释放出的氨基酸、维生素等物质，有利于乳酸菌的生长繁殖。由于酵母发酵液只有灭活和不灭活两个水平，初步试验表明灭活较不灭活的效果好，故将酵母灭活这一水平重复，作为一个拟水平进行正交试验。正交试验结果见表3。由表3可知，影响发酵液感官评分的因素主次顺序是：酵母发酵液是否灭活>乳酸菌发酵时间>乳酸菌发酵温度，A3B2C1为最佳组合，即酵母发酵液灭活后，接种保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌组合菌种，37 ℃恒温静置培养，发酵时间12 h。按此工艺方案所得发酵液经杀菌后离心澄清，色泽橙黄透亮，组织均匀，具有适宜的香味且酸味醇厚。

3 结论

保加利亞乳杆菌、嗜热链球菌、植物乳杆菌等3种乳酸菌及其组合在麦芽汁中生长速率较MRS相对缓慢，但都能适应麦芽汁基质；3种乳酸菌及其组合在麦芽汁中的产酸情况基本相同；其中植物乳杆菌无论是单独还是与其他菌株混合发酵，均会使发酵液带有一种涩口感，并且有明显的杂味，故排除植物乳杆菌。乳酸菌和酵母菌混合发酵麦芽汁最佳工艺条件为：在12%麦芽汁中按4%（V/V）的接种量接种啤酒酵母，28 ℃恒温培养，发酵8 h后将发酵液进行巴氏灭菌，用白砂糖调整发酵液的浓度为12%，再按2%（V/V）接种保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌组合（1∶1，体积比）菌种，37 ℃恒温培养，发酵时间12 h。麦芽价格低廉，来源广泛，乳酸菌与酵母菌混合发酵不仅可除去麦芽汁的异味，而且还可赋予其特殊香味。

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