光谱法研究头孢西丁钠与牛血清白蛋白的相互作用

刘里

摘要：在优化的试验条件下，运用荧光光谱和紫外-可见光谱法研究了头孢西丁钠（CS）与牛血清白蛋白（BSA）之间的相互作用和共存金属离子对CS与BSA的相互作用的影响。计算了不同温度下的热力学参数、结合常数和结合位点数。结果表明，CS对BSA的猝灭机制属于形成复合物的静态猝灭过程；两者之间的作用主要是氢键或范德华力。CS在BSA中的结合位点主要位于ⅢA。Hill系数nH>1，表明CS有强的协同作用。根据同步荧光光谱法研究了CS对BSA构象的影响。考察了Fe3+、Mn2+、Cr2+、Ni2+、Mg2+金属离子对两者相互作用的影响，结果表明金属离子对CS与BSA的结合常数和结合位点数均有影响，降低了其结合能力。

关键词：头孢西丁钠；相互作用；金属离子

中图分类号：R96 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）04-0971-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.039

Study on Interaction between Cefoxitin Sodium and Bovine Serum Albumin and the Effect of Coexistent Metal Ion on the Reaction by Spectrometry

LIU Li

（College of Chemistry and Chemical Engineering， Qujing Normal University， Qujing 655011， Yunnan， China）

Abstract： Under the optimized conditions， the interaction of cefoxitin sodium （CS） with bovine serum albumin（BSA） and the effects of the coexisted metal ion on the reaction were investigated by fluorescence spectrometry and ultraviolet-visible light absorption spectrometry. The evaluation index was the binding constants， number of binding sites and thermodynamic parameters under different temperatures. The results showed that the quenching of BSA by CS was a static quenching procedure involving complex formation. The interaction between BSA and CS was dominated by Van Der Waals forces or hydrogen bond. The primary binding site for TI was located at sub-domain ⅢA of BSA. The values of Hill's coefficients were more than 1， which suggested that there was some strong positive cooperative effect. The effect of CS on the conformation of BSA was analyzed by synchronous fluorescence spectrometry. The metal ion such as Fe3+、Mn2+、Cr2+、Ni2+ and Mg2+， had effects on the binding constants and binding sites numbers of CS and BSA and declined its abilities of combination.

Key words：cefoxitin sodium；interaction； metal ions

头孢西丁钠（Cefoxitin sodium，CS），常用于呼吸道感染、心内膜炎、腹膜炎、肾盂肾炎、尿路感染、败血症以及关节、皮肤和软组织等感染的治疗[1]，是一种安全、有效的抗生素。药物与血清白蛋白作用力的大小直接影响到药物在体内的分布、清除以及药效等重要生命过程。因此，研究药物与血清白蛋白的结合作用对理清药物的作用机制意义重大[2-4]。因为结构上和人血清白蛋白的相似性，牛血清白蛋白（BSA）广泛运用于和药物结合的研究[2-4]。至今还未见光谱法研究CS和BSA相互作用的报道，而且以往研究药物与BSA结合作用主要集中在猝灭机理的判断上。而本试验从不同的方面研究了CS与BSA的结合反应，除了常规的作用机理及结合特征的研究，还深入探讨了两者的结合位置、药物之间的协同性以及金属离子对CS与BSA结合反应的影响。这些研究对于阐明CS在机体内的传输、代谢过程及药理作用具有有益的参考意义。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

荧光光谱仪：F-4600，日本日立公司，狭缝宽度 10.0 nm，负高压为 400 V；紫外-可见光谱仪：Cary 50型，美国瓦里安技术中国有限公司。牛血清白蛋白（上海楷样生物技术有限公司）配成1.0×10-4 mol/L溶液，头孢西丁钠（百灵威科技有限公司） 配成1.54×10-4 mol/L溶液，三羟甲基氨基甲烷（Tris，成都化学试剂厂） 制成0.2 mol/L的溶液，试验用水为超纯水。

1.2 试验方法

准确移取0.2 mol/L、pH 7.5的Tris-HCl缓冲溶液1.0 mL于10.0 mL比色管中，加入0.5 mol/L NaCl溶液2.0 mL以保持反应体系的离子强度。再加入1.0×10-6 mol/L的BSA 2.25 mL和0、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0 mL的1.54×10-4 mol/L的CS溶液，用水释至刻度并摇匀。荧光分光光度计记录荧光光谱，其最大激发/发射波长（λex/λem）位于280 nm/344 nm 处，扫描荧光猝灭光谱和同步荧光光谱（Δλ分别为15 nm和60 nm）记录F和F0（F和F0分别指CS存在与不存在时BSA的荧光强度）。以相应的CS溶液作为参比，记录CS-BSA体系的吸收光谱。按照上述条件，在CS-BSA体系中加入浓度均为1×10-3 mol/L金属离子（Mn2+、Ni2+、Cr3+、Fe3+、Mg2+）0.2 mL，测定其荧光光谱。

2 结果与分析

2.1 对适宜反应条件的探究

分别考察了缓冲溶液种类、pH、缓冲溶液的用量、BSA的浓度以及试剂加入顺序对体系荧光强度的影响，结果表明，选用0.02 mol/L、pH 7.5的Tris-HCl缓冲溶液1.0 mL调节酸度，2.25×10-6 mol/L BSA作为反应浓度，CS→BSA→NaCl→Tris-HCl的加入顺序进行测量时效果最佳。

2.2 猝灭光谱

在试验条件下，固定BSA的浓度，在激发波长为280 nm的条件下，扫描复合物CS-BSA的荧光光谱得图1。由图1可知，随着CS浓度的增大，最大激发波长红移，BSA的内源荧光有规律地降低，但是峰形未发生变化，表明CS可以猝灭蛋白质的内源荧光。

2.3 猝灭类型的确定

荧光猝灭机理类型分为动态猝灭和静态猝灭[5-7]。常用温度的变化来确定猝灭类型。在动态猝灭中分子扩散起主导，猝灭常数会随着温度的升高而增大；对于静态猝灭，因有新物质生成，稳定性起主导作用，温度越高，猝灭常数反而越小[5-7]。猝灭过程遵循S-V方程：F0/F=1+KSV[C]=1+Kqτ0[C]，式中KSV为猝灭常数；Kq为速率常数[最大值约为2×1010 L/（mol·s）]；τ0为荧光体平均寿命，一般为10-8 s数量級；[C]为CS的浓度。由表1可知，3个温度下Kq均大于2×1010 L/（mol·s），所以初步判断猝灭过程为静态猝灭；又由图2可见，随着反应温度的升高，直线斜率即Ksv逐渐降低，进一步说明CS与BSA的猝灭作用属于静态猝灭。

若为静态猝灭，则应符合L-B方程[8-10]：（F0-F）-1=F0-1+（KLBF0[C]）-1，式中KLB为静态荧光猝灭解离常数，（F0-F）-1-[C]-1作不同温度下的L-B曲线，结果见表2。由表2可见，KLB值都在104数量级，结合力很强，并且随着温度升高，KLB越来越小，表明CS与BSA的结合是符合静态猝灭特征的。

考察荧光体的吸收光谱是区分反应体系为静态猝灭还是动态猝灭的另一种方法，动态猝灭仅仅影响荧光体的激发态而不影响荧光体的吸收光谱，而基态配合物的形成会引起荧光体吸收光谱的变化[5-7]。由图3可知，CS和BSA的叠加紫外吸收光谱和药品作用下的BSA紫外吸收光谱不重叠，最大吸收波长由277 nm红移至280 nm。由此可证明CS对BSA的猝灭作用为静态猝灭。

2.4 CS与BSA结合常数及结合位点数的计算

如药物小分子与BSA大分子存在n个等同且独立的结合位点，它们之间相互作用关系符合公式lg[（F0-F）/F]=lgK+nlg[C][8-10]。分别在297、312、327 K温度下，以lg（F0-F）/F对lg[C]作图，通过线性拟合可得到直线的斜率和截距，由直线的斜率和截距可求出CS与BSA不同温度下的结合常数K及结合位点数n，见表3。由表3可知，3个温度下的n均大于1，K至少达到104，表明CS与BSA的相互作用较强。总体趋势来看n和K随温度升高而增大，当温度为327 K时，n接近2，温度的提升有利于血清白蛋白携带着CS在体内进行运转、贮存和分配。

2.5 CS与BSA作用力类型的确定

静电引力、疏水作用力、氢键和范德华力等是药物小分子与蛋白质大分子的主要结合作用力[8-10]。把结合反应的焓变ΔH看作是一个常数（温度变化范围不大时）[8-10]。根据热力学公式[8-10]计算CS与BSA结合反应的ΔH，熵变ΔS及吉布斯自由能变ΔG，结果见表4。根据Ross等[11]、Sulkowska等[12]、刘保生等[13]总结出的规则进行判断，由表4可得，ΔG<0，表明BSA与CS的反应能自发进行，ΔH<0，表明反应为放热反应，ΔS<0，表明反应过程为熵减小过程，ΔH<0、ΔS<0，说明氢键和范德华力为CS与BSA的主要作用力。

2.6 CS与BSA相互作用的同步荧光光谱

血清白蛋白的构象变化通常用同步荧光光谱来分析，根据最大发射波长Δλ的变化来确定[8-10]其荧光主要来自于何种氨基酸残基，而且氨基酸残基的λmax与其所处的疏水性也紧密相关[8-10]。酪氨酸残基的特征荧光由Δλ=15 nm时测得的同步荧光光谱显示；色氨酸残基的特征荧光由Δλ=60 nm测得的同步荧光光谱显示[8-10]。Δλ=15 nm和Δλ=60 nm测BSA的同步荧光光谱（图4）。由图4可见，随CS浓度的增大，Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的λmax均有红移，Δλ=15 nm酪氨酸从281 nm红移至285 nm，红移了4 nm；Δλ=60 nm色氨酸残基从280 nm红移至285 nm，红移了5 nm。表明CS与BSA作用改变了色氨酸、酪氨酸残基所处的微环境，氨基酸微环境的改变使得BSA腔内疏水环境的极性增强，疏水性减弱，从而导致BSA的构象发生了变化。

2.7 结合位置的确定

与人血清白蛋白相似，BSA含有3个ɑ-螺旋域（Ⅰ-Ⅲ），每个ɑ-螺旋域包含两个亚螺旋域A和 B。为确定药物小分子与BSA结合的具体位置并反映出在两者的作用过程中色氨酸残基和酪氨酸残基的实际参与情况，用文献[12-14]提出的方法，即比较280 nm和295 nm激发时的体系荧光猝灭曲线。由图5可知，两种激发波长下，CS与BSA的猝灭曲线是独立的，而且猝灭程度是在280 nm时比295 nm时要小，这一现象说明在CS与BSA的猝灭反应中，色氨酸和酪氨酸残基都参与其中，结合位点主要位于亚螺旋域的ⅢA中。

2.8 药物协同性

Sulkowska等[12]、刘保生等[13]、梁宏等[14]认为药物协同性是指药物与具有多重结合部位的BSA结合过程中各结合部位之间可能存在相互影响作用，可用Hill方程[12-14]进行分析：lgH/（1-H）=lgK+nHlg[C]，式中，H为结合饱和分数，K为结合常数，nH为Hill系数。在荧光试验中：H/（1-H）=B/（Bm-B），其中，B=（F0-F）/F0；1/Bm是1/B对1/[C]作图的截距。CS-BSA的nH值的计算结果见表5。表5中3个温度下的nH都大于1，表现为正协同作用。随温度的升高，nH逐渐增大而且变化较大，表明药物协同性对温度变化很敏感。当温度为327 K时，nH大于2，表现为较强的正协同作用。即前一个药物分子结合到BSA位点上后，有利于后一个药物分子与BSA的结合。

2.9 金属离子对体系的影响

金属离子与蛋白质有一定的结合力[2]，金属离子的存在会直接影响药物与蛋白质结合[8，9]。为此，测定了几种常见金属离子Mn2+、Ni2+、Cr3+、Fe3+、Mg2+对CS-BSA体系相互作用的影响，结果见表6。从表6中可明显看出，金属离子不同，K′和n也不同，其原因可能是由于金属元素本身的原子结构不同，才导致与BSA的结合力和结合位点的差异。这五种常见金属离子的K′都比原体系的K小，其中Cr3+对体系的影响最大，可能是金属离子与BSA先结合，占据了BSA的结合位点，从而使CS与BSA结合作用减弱。但CS与血清白蛋白结合力减弱，可能会缩短药物的存储时间，增大药物的最大作用强度[8-10]。

3 结论

用荧光和紫外光谱法推断出CS對BSA荧光产生静态猝灭，两者靠氢键和范德华力作用力结合；通过计算求得了K和n值的大小，表明CS可以被BSA运输；两者结合位置位于BSA的亚螺旋域ⅢA中；在CS与BSA结合过程中，药物分子之间有较强的正协同性；CS对BSA的构象产生一定的影响；详细研究了Fe3+、Mn2+、Cr2+、Ni2+、Mg2+对CS与BSA相互作用的影响。

参考文献：

[1] 中华人民共和国药典（2005年版二部）[M].北京：化学工业出版社，2005.921.

[2] 汪世龙.蛋白质化学[M].第一版.上海：同济大学出版社，2012.139.

[3] 薛春霞，董社英.药物分子与血清白蛋白相互作用的研究进展[J].广东化工，2013（20）：148-149.

[4] 王 芳，裴明砚，唐 乾，等.药物与血清白蛋白相互作用中荧光光谱学的研究进展[J].大连大学学报，2009（3）：39-43.

[5] LAKOWICZ J R. Principles of Fluorescence Spectroscopy 3rd ed[M].New York：Springer Press，2006.280.

[6] 许金钩，王尊本.荧光分析法[M].第三版.北京：科学出版社，2006.

[7] 陈国珍，黄贤智，郑朱梓，等.荧光分析法[M].第二版.北京：科学出版社，1990.

[8] SAD LER P J，TUCKER A，VILES J H. Involement of lysine residue in the N-teminal Ni2+ and Cu2+ binding site of serum albumins comparison with Co2+，Cd2+，Al3+[J]. Eur J Biochem，1994，220（1）：193-200.

[9] 董黎明，邹淑君，许树军，等.荧光法研究金属离子对橙皮素与牛血清白蛋白相互作用的影响[J].分析实验室，2014，33（4）：483-488.

[10] 付彩霞，高宗华.金属离子对叶酸与牛血清白蛋白相互作用的影响[J].理化检验-化学分册，2014，50（2）：177.

[11] ROSS P D， SUBRAMANIAN S. Thermodynamic of protein association reactions： forces contributing to stability[J]. Biochemistry，1981，20（11）：3096-3102.

[12] SULKOWSKA A，MACIAZEK-JURCZYK M，BOJKO B，et al.Competitive binding of phenylbutazone and colchicine to serum albumin in multidrug therapy[J]. J Mol Struct，2008， 881（1-3）：97-106.

[13] 刘保生，杨 超，王 晶，等.硫酸头孢匹罗与牛血清白蛋白结合反应的发光机理[J].发光学报，2011，32（3）：295-296.

[14] 梁 宏，边贺东，涂楚桥，等.La（Ⅳ）与HAS或BSA的结合平衡研究[J].高等学校化学学报，2001，22（1）：21-25.