盐度胁迫对花鲈幼鱼肠道抗氧化和非特异性免疫能力的影响

王海亮 温海深 张晓燕

摘要 试验比较不同盐度处理对花鲈幼鱼抗氧化酶和非特异性免疫酶的影响。设置5‰、15‰、20‰、25‰ 4个盐度处理组，10‰对照组。分别在试验开始（即盐度胁迫开始）的第1天、第11天和第21天采集肠道为试验样品，并进行超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶活力和丙二醛含量的测定。结果表明：在高盐度和低盐度的胁迫下，花鲈幼鱼肠道各测定指标都表现出了显著的变化。超氧化物歧化酶和过氧化氢酶变化趋势表现出一致性，在5‰、15‰、20‰、25‰盐度中活力都显著升高（P<0.05），并随着时间推移而逐渐降低，在21 d时25‰处理组测得活力最低值。在急性盐度胁迫下，酸性磷酸酶活力有降低的趋势，并且在低盐度（5‰）急性胁迫下活力显著降低（P<0.05）；而随着时间，活力又有所回升，到21 d时恢复正常水平。21 d时，25‰盐度组酸性磷酸酶活力最高，显著高于其他组（P<0.05）。碱性磷酸酶在盐度胁迫下活力也受到抑制，在第1天25‰处理组测得活力最低值，随着时间，各处理组活力得到恢复，25‰处理组在21 d时活力达到最高值。在急性盐度胁迫下，丙二醛含量显著升高（P<0.05），而后，在21 d恢复正常水平。结果表明，盐度胁迫对花鲈肠道抗氧化酶和非特异性免疫酶活力都有显著影响。

关键词 花鲈；盐度胁迫；抗氧化酶活力；非特异性免疫

中图分类号 S968.25 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）04-0261-03

Effects of Salinity Stress on Antioxidant Enzyme and Non-specific Immunity Activities in the Intestine of Juvenile Lateolabrax maculatus

WANG Hai-liang Wen Hai-shen * ZHANG Xiao-yan

（Key laboratory of Mariculture，Ministry，Ocean University of China，Qingdao Shandong 266003）

Abstract The effects of salinity on the non-specific immunity and the antioxidant enzyme activities in juvenile Lateolabrax maculatus were investigated in this research. The salinity of aquaculture water were maintained at 5‰，15‰，20‰ and 25‰ in four experimental groups，and group of 10‰ was used as control. We collected intestine as samples on day 1，11 and 21 during the experiment，and determined the changes of superoxid dismutase（SOD），catalase（CAT），acid phosphatase（ACP），alkaline phosphatase（AKP），and malondialdehyde（MDA）. The results revealed that the activities had significant changes in high and low salinity water. Changes of SOD and CAT were corresponding，and activities of SOD and CAT increased obviously（P<0.05）before a decline. The activity of ACP showed a downward trend，and the the trend was significant in 5‰ water（P<0.05）during the acute salinity stress. The activity of AKP was inhibited during acute salinity stress，and reached the minimum in 25‰ at the first day. The activity of AKP increased to the nomal value，and reached the maximum in 25‰ on 21 day. The content of MDA showed a increasing trend before a downward trend，and remained stable. In conclusion，salinity stress could result to significant changes of the non-specific immunity and the antioxidant enzyme activities.

Key words Lateolabrax maculatus；salinity stress；antioxidant enzyme activities；non-specific immunity

鹽度是水生生物的重要环境因子，能够显著影响鱼类的生长、存活、代谢及非特异性免疫[1-3]。水体盐度受到多方面因素的影响，诸多人为因素和自然因素都会引起盐度的变化。有研究表明，盐度的变化能够引起鱼类的应激反应，导致鱼体能量消耗增加，代谢加速，耗氧增多[4]。同时，在高盐度或低盐度胁迫下，鱼体体质会变差，容易受到病原体的入侵，引起鱼体疾病，甚至死亡[5]。此外，盐度的变化还能够引起鱼体活性氧自由基（ROS）的增多，若不能够及时清除会引起鱼体氧化损伤。长期处于这种氧化状态之下，鱼体的免疫能力和抵抗力下降[6]。

抗氧化机制是鱼类防止氧化损伤的主要屏障，它能够清除体内氧自由基，增强机体的抵抗力，维持体内动态平衡。超氧化物歧化酶（SOD）是重要的自由基清除剂，它能保护机体免受氧化损伤。过氧化氢酶（CAT）能够将过氧化氢分解为水和氧气，对于维持鱼类细胞的氧化还原状态及对氧化应激的防御起着关键的作用。非特异性的体液免疫和细胞免疫系统是鱼类抵抗外来病原入侵的第一道防线[7]。酸性磷酸酶（ACP）作为溶酶体的标志酶，具有清除衰老或死亡的细胞和细胞器，识别、吞噬和降解入侵的病原体的作用，同时在免疫防护方面具有重要作用。碱性磷酸酶（AKP）是动物溶酶体的组成部分，参与营养物质的吸收、利用，钙的代谢，在免疫反应中也发挥重要作用[8]。丙二醛（MDA）是脂质过氧化物，可以间接反映组织细胞脂质过氧化的程度，而且还可以间接反映活性氧自由基产生的数量。因此，抗氧化酶和免疫酶在维持鱼体稳态，增强抵抗力方面具有重要的作用。

花鲈（Lateolabrax maculatus）隶属于鲈形目鮨科花鲈属，主要分布于太平洋西部，在我国黄海、渤海等海域及朝鲜半岛均有分布，是我国重要海产经济鱼类之一。花鲈是一种广盐性鱼类，在海水、半咸水、淡水中都有养殖。然而，对花鲈在盐度胁迫下，免疫和抗氧化方面的研究还较少。该文以花鲈幼鱼为研究对象，通过测定不同盐度胁迫下，肠道超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、酸性磷酸酶（ACP）碱性磷酸酶（AKP）的活力以及丙二醛（MDA）的含量的变化，探讨花鲈在盐度胁迫下抗氧化能力和免疫能力的变化，分析花鲈对盐度变化的适应性。通过该项研究，在理论上丰富花鲈免疫生理学研究内容，在生产实践上为花鲈的健康养殖和水环境调控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验鱼种。试验所用花鲈为珠海市斗门区河口渔业研究所池塘养殖的幼鱼，试验之前在盐度为10‰的水泥池中暂养10 d。试验选用体质健壮、活力旺盛的幼鱼进行，试验用鱼体长为（5.56±0.68）cm、体重为（1.50±0.31）g。

1.1.2 试验试劑。试验测定超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶活力和丙二醛、蛋白含量所用试剂盒均采购于南京建成生物工程研究所。

1.2 试验设计

试验在30 L的塑料箱中进行，分为5‰、10‰、15‰、20‰、25‰ 5个盐度组，其中10‰为对照组（CK），每个处理3个平行。试验过程中每日换水1/3，试验用水为曝气自来水和过滤海水配制而成。24 h不间断充气，及时清除残余饵料及粪便。

1.3 样品采集

在试验开始的1 d、11 d和21 d采集样品，每个时间点在每个塑料箱中采集3尾鱼，将其用MS-222麻醉剂进行快速麻醉，解剖后采集其肠道，迅速放入离心管中，保存于液氮，待测。

1.4 样品的制备

准确称取0.2 g样品，按重量体积比1∶9（g/mL）向样品中加入生理盐水，在冰水浴条件下，采用转速为2 500 r/min离心10 min，取上清液，保存于-20 ℃冰箱中，在1周内进行测定。

1.5 酶活力的测定

蛋白质浓度的测定运用考马斯亮蓝法，考马斯亮蓝遇蛋白质显现蓝色，在595 nm波长处测其吸光度，再转换为蛋白质含量；超氧化物歧化酶采用黄嘌呤氧化酶法测定，在显色剂作用下反应系统呈现紫红色，在550 nm波长处测定其吸光度，通过公式转化为酶活力值。定义1 mg组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个活力单位（U）。过氧化氢酶采用钼酸铵法测定[8]，过氧化氢与钼酸铵产生黄的淡络合物，在405 nm波长处测定其吸光度，计算转化为酶活力。定义1 mg组织蛋白1 s分解1 μmol过氧化氢的量为一个活力单位（U）。酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活力的测量采用磷酸苯二钠法，2种酶与磷酸苯二钠作用产生红色的衍生物，在520 nm波长处测其吸光度，转化为酶活力。酸性磷酸酶定义1 g组织蛋白在37 ℃与基质作用30 min产生1 mg酚为1个金氏单位。碱性磷酸酶定义1 g组织蛋白在37 ℃与基质作用15 min产生1 mg酚为1个金氏单位；丙二醛采用硫代巴比妥酸（TBA）法进行测定，反应体系产生红色产物，在532 nm波长处测其吸光度，计算转换为丙二醛含量。

1.6 数据分析

该试验数据用平均值±标准差表示，利用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）以及Duncan多重比较检验数据差异的显著性，以P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 盐度胁迫下超氧化物歧化酶活力的变化

如图1所示，在急性胁迫的第1天，随着胁迫强度的增加，SOD活力逐渐增强，1 d时25‰组活力显著高于其他各盐度（P<0.05）。在11 d时，各盐度组之间，SOD活力差异不明显（P>0.05），已经基本恢复至正常水平。在21 d时，25‰处理组SOD活力显著低于其他盐度组（P<0.05）。在5‰、10‰处理组，随着时间变化，SOD活力变化不明显。而15‰、20‰、25‰盐度组第1天SOD活力显著高于另外2个时间点。

2.2 盐度胁迫下过氧化氢活力的变化

盐度胁迫下CAT活力变化如图2所示。总体看来，CAT变化趋势和SOD有很高的相似性。在急性盐度胁迫作用下，第1天胁迫组CAT活力有增高的趋势，25‰盐度组活力最高，5‰盐度处理组次高，其余3个盐度组没有显著性变化（P>0.05）。在第11天，各组活力逐渐恢复至正常水平。胁迫后21 d，各盐度组没有表现出显著性差异（P>0.05），此时25‰组CAT活力最低。在同一盐度各不同时间处理组中，5‰、10‰、15‰盐度组在各时间点之间没有显著性差异，变化较小。20‰和25‰盐度组第1天的CAT活力显著高于11 d和21 d（P<0.05），而后二者之间没有显著差异（P>0.05）。

2.3 盐度胁迫下酸性磷酸酶活力的变化

如图3所示，花鲈在盐度胁迫下，酸性磷酸酶的活力有降低的趋势。在急性胁迫的第1天，各处理组酸性磷酸酶活力都低于对照组，并且低盐度胁迫（5‰）下，活力降低最为显著（P<0.05）。在第11天，25‰盐度组活力迅速上升，活力显著高于其他各组（P<0.05）。在21 d，CAT活力随盐度升高而升高。各盐度处理组，随着时间的推延，CAT活力都有上升的趋势。

2.4 盐度胁迫下碱性磷酸酶活力的变化

如图4所示，在盐度的急性胁迫下，碱性磷酸酶活力在第1天的各处理组中都有下降的趋势，5‰、20‰、25‰显著低于对照组（P<0.05）。在11 d时，各处理组AKP活力都有所回升，各组之间也表现出明显的差异。在21 d，25‰组AKP活力快速升高，并显著高于其他盐度组。AKP活力在总体上也表现出随盐度升高而上升的趋势。

2.5 盐度胁迫下丙二醛含量的变化

盐度胁迫下，MDA含量变化如图5所示，在急性胁迫的第1天，各处理组MDA都显著升高（P<0.05），且随着胁迫强度的增加，MDA含量升高。在11 d，各处理组MDA含量都显著下降（P<0.05）。在胁迫后的第21天，各盐度组MDA含量都恢复正常水平，含量比较低。

3 讨论与结论

抗氧化机制和非特异性免疫体系在维持鱼类动态平衡、增强鱼体抵抗力等方面具有重要作用[9]。该研究发现，试验中所测得的抗氧化酶和非特异性免疫酶类在盐度胁迫下都有较为显著的变化。这也说明盐度胁迫对花鲈幼鱼抗氧化能力和非特异性免疫能力有显著的影响。超氧化物歧化酶是重要的抗氧化酶，能够清除体内超氧自由基（O2-），保护鱼体细胞免受活性氧自由基的损伤，是抗氧化机制中的关键酶[10]。有研究发现，当鱼类生存环境（盐度、水温、溶解氧等）发生变化时，均能够引起鱼体抗氧化能力的变化[11]。在盐度急性胁迫开始的第1天，盐度处理组SOD活力较对照组（10‰）升高，这是由于在盐度胁迫下，鱼体要消耗更多的能量来维持身体平衡，而在这个代谢旺盛的过程中會产生大量的活性氧自由基，SOD活力升高用以清除这些自由基，进而保护鱼体免受氧化损伤。在11 d的样品中，各盐度条件下SOD活力没有显著差异，推测这是随着时间推移，鱼体适应各自盐度环境的缘故。21 d时，25‰盐度组SOD活力显著低于其他组，这可能是由于此盐度是花鲈幼鱼最适生长盐度，因此受到胁迫压力小而其SOD活力也较低。

过氧化氢酶（CAT）是生物体内过氧化物酶类的标志酶，占过氧化物总酶体量的40%[12]。CAT能够将体内的过氧化氢分解成水和氧气，保护机体免受氧化的危害。该研究发现，盐度胁迫下，花鲈幼鱼肠道中SOD和CAT在急性盐度胁迫下的变化趋势高度相似，推测这是由于二者在功能上的协同性导致的[13]。胁迫后第1天，各处理组CAT活力都显著升高，且随着胁迫强度的增加，CAT活力升高也更加显著，推测这与SOD变化原因相同。但是，可以发现低盐度胁迫（5‰）对花鲈幼鱼的影响较高盐度强烈。在之后各时间点，CAT恢复正常水平，推测是由于花鲈幼鱼此时已经适应各自的盐度环境，胁迫程度也显著降低。

酸性磷酸酶（ACP）是高等动物体内巨噬细胞溶酶体的标志性酶，在体内直接参与磷酸基团的转移和代谢[14]。酸性磷酸酶作为溶酶体的标志酶，参与消除生物大分子，维持细胞正常代谢活动，清除衰老或死亡的细胞和细胞器，识别、吞噬和降解入侵的病原体，在免疫防护方面起重要作用[15]。该试验发现，在胁迫试验开始的第1天，各盐度处理组ACP活力低于对照组，低盐度胁迫（5‰）ACP活力显著低于对照组，这可能是由于盐度的急性变化抑制了ACP的活力，并且低盐度胁迫的抑制作用明显。随着鱼体对环境的适应，在11 d和21 d各盐度处理组ACP活力都有所上升。在最后一次采得的样品中，ACP活力显现出随着盐度升高而升高的趋势，根据白秀娟等在文昌鱼（Branchiostoma lanceolatum）中的研究结果[16]，推测这是由于金属离子对ACP活力的激活作用。

碱性磷酸酶（AKP）是溶酶体酶的重要组成部分，在鱼体的生长、物质代谢以及免疫方面具有重要作用[17]。在该试验中，急性盐度胁迫下，AKP活力在第1天受到抑制。各盐度组AKP活力随着时间都有显著升高的趋势。且随着盐度的升高，AKP活力也有升高的趋势。与该试验结果相比较，刘存歧等发现海水中金属离子的升高对酸性磷酸酶活力有促进作用[18]；冯 娟等在军曹鱼（Rachycentron canadum Linnaeus）盐度胁迫的试验中得到的结果与该文试验结果一致[19]。推测这种变化趋势是由于水中金属离子对AKP活力的促进作用。

丙二醛（MDA）是脂质过氧化物，MDA含量的高低能够直接反应脂质氧化的程度，也能间接反应自由基的数量。因此其可以作为脂质氧化程度和自由基产生数量的反应指

标[20]。在盐度胁迫初期（1 d），各盐度处理组MDA含量显著高于对照组。这是由于在盐度胁迫下，花鲈幼鱼需要消耗额外的能量来维持机体渗透压平衡，在这些过程中产生的活性氧自由基将脂质氧化，从而导致MDA含量增多。随着SOD和CAT等抗氧化酶类活力的增加，MDA含量在第11天和第21天活力都显著降低，最后恢复至正常水平。

盐度是鱼类生存的重要环境因子，盐度的变化会引起鱼体的应激反应，同时也会导致鱼体抵抗力的下降，病原体便可乘机而入，导致鱼体疾病。该研究发现，急性盐度胁迫能够对鱼体造成氧化压力，此时，SOD和CAT等重要的抗氧化酶类在避免鱼体氧化损伤方面具有重要作用。在非特异性免疫方面，急性盐度胁迫会造成鱼类ACP、AKP等免疫酶类活力的暂时性抑制，而高盐度会对ACP和AKP活力具有促进作用。综上所述，花鲈养殖过程中盐度胁迫会引起体内氧化应激、抵抗力下降。25‰是花鲈较为适宜的生长盐度，此时鱼体抵抗力水平较高，不易患病。因此，在花鲈养殖生产过程中要注意盐度的变化，避免由于抵抗力下降导致鱼体疾病。

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