鸡体抗病毒蛋白基因荧光定量PCR检测方法的建立和初步应用

黄艳艳　高丹丹　许传田　杨少华　黄庆华　张琳　张秀美　吴家强

摘要：为建立检测鸡干扰素诱生的3种抗病毒蛋白（IFIT5、PKR和OASL）基因表达水平的荧光定量PCR方法，并将其应用于实践，本研究设计和筛选了3个基因的特异性扩增引物，制备了各基因的质粒标准品，绘制了荧光定量PCR的标准曲线，并检测了该方法的灵敏度、重复性和特异性。结果表明所建立的方法敏感度高、特异性强、检测线性范围广、重复性好，应用该方法检测了新城疫病毒感染SPF鸡胚后相关基因的表达情况，发现在病毒感染后IFIT5、PKR与OASL基因的表达水平均迅速提高。

关键词：鸡；抗病毒蛋白；检测；荧光定量PCR

中图分类号：S851.34⁺7.201 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）04-0119-05

当病毒感染动物机体时，病毒以其携带的病原相关分子模式（pathogen-related molecular pat-tem，PAMP）识别机体细胞的模式识别受体（pat-tem-recognition receptor，PRR），进而激活相应的配体，启动机体固有免疫通路的转导，诱导产生干扰素（Interferon，IFN）和促炎性细胞因子。干扰素并不直接作用于病毒，而是通过激活干扰素刺激基因（IFN stimulated genes，ISGs）的转录和表达，产生多种抗病毒蛋白（Antiviral protein，AVP）而发挥机体的抗病毒效应。目前发现的ISGs已超过300种。在ISGs表达产生的为数众多的抗病毒蛋白中，双链RNA依赖的蛋白激酶（Double-stranded RNA-dependent protein ki-nase，PKR）、2，5腺苷酸合成酶（2，5-Oligoadenylate synthetase，OAS）和IFIT（In-terferon induced proteins with tetratricopeptide re-peats）家族分子在机体抵抗多种病毒感染中发挥着十分重要的作用。

建立灵敏、快速的抗病毒蛋白定量检测方法，对于深入了解病毒的致病机制、研究开发新型疫苗和抗病毒药物均具有非常重要的意义。荧光定量PCR（Q-PCR）技术是目前对基因表达进行定量检测的金标准，被广泛应用于各种样品中基因mRNA水平的检测。其中SYBR Green I荧光染料法以其使用方便、成本低廉等优点而被广泛使用。本研究旨在建立检测鸡PKR、OASL和IFIT5基因转录水平的实时荧光定量PCR方法，并将其用于检测病毒感染后相应基因的表达变化，以验证所建立方法的实际应用效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新城疫病毒（NDV）弱毒疫苗株LaSota、NDV分离株Duck/China/SD03/2009，由山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室保存；9～11日龄SPF鸡胚，购买自山东省农业科学院家禽研究所SPF鸡研究中心。

1.2 试剂

pUC57载体、DH5α感受态细胞、荧光定量PCR预混液（Master Mix）和缓冲液（Buffer），购自上海生物工程有限公司（Sangon）；Trizol、TE缓冲液、反转录试剂盒和高保真酶PCR试剂盒，In-vitrogen公司产品；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒，购自Qiagen公司；IPTG（异丙基硫代-β-半孚L糖苷）、X-gal（5-嗅-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和氨苄青霉素，购自宝生物工程（大连）有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物和琼脂粉，购自OXOID公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 引物的设计

从GenBank下载鸡IFIT5、PKR、OASL的基因序列（登录号：XM_421662、NM_204487和NM_205041），作为引物设计的模板。利用PrimerPremier 5.0设计PCR扩增引物多对。选取β-actin基因作为内参基因，一并设计引物。

1.4 质粒标准品的制备

利用NDV弱毒疫苗株LaSota感染11日龄的SPF鸡胚，从而激活鸡胚固有免疫基因的转录表达。以Trizol法提取病毒感染24 h的鸡胚尿囊液的总RNA，使用随机引物法将RNA反转录为cD-NA。利用上述设计的引物，以cDNA为模板分别进行PCR，扩增3个基因的相应片段。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，选取产物条带单一、亮度高而且条带大小与预期一致者，用于胶回收。将回收产物与pUC57载体连接，转化人大肠杆菌DH5α感受态细胞，经细菌培养后挑取白色单菌落扩大培养，然后进行菌液PCR鉴定，将鉴定正确的阳性重组质粒菌液送上海生工生物公司测序验证。测序结果分别与各基因的参考序列进行比对，以确定插入片段正确与否。并据此筛选出各基因的最佳扩增引物，其序列见表1。

测序正确的质粒分别命名为pUC57-Ch-IFIT5、pUC57-Ch-PKR和pUC57-Ch-OASL。使用核酸/蛋白紫外检测仪测定各重组质粒的纯度（OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.8左右为高纯度DNA）和浓度，并换算为质粒拷贝数，置于一20℃保存。质粒拷贝数计算公式为：

拷贝数（拷贝/μL）=6.02×10²³×质粒浓度（g/μL）/MW

MW（g/mol）=质粒大小（bp）×660g/（mol·bp）。

1.5 Q-PCR反应条件的优化和标准曲线的绘制

以不同的退火温度进行PCR，扩增上述3个基因，确定其共同的最佳退火温度。然后以最佳退火温度进行引物浓度梯度的Q-PCR，优化各基因的引物使用量。将指数扩增开始时Ct值最小、扩增曲线为典型的S型以及扩增产物的荧光增量值最高的反应中使用的引物浓度作为最佳引物浓度。

分别以8个浓度梯度的pUC57-Ch-IFIT5、pUC57-Ch-PKR和pUC57-Ch-OASL为模板，使用优化的反应体系和循环参数进行Q-PCR，绘制反应的标准曲线，建立回归方程。

1.6 特异性试验

对扩增产物进行熔解曲线的分析来验证Q-PCR的特异性，单一产物表现为单个熔解曲线峰值。此外，使用建立的Q-PCR方法扩增对照基因，若无扩增则表明方法的特异性强。本研究中使用的对照基因样品为本实验室制备的13种天然免疫信号通路分子（ChMDA5、ChTLR3、ChTLR7、MAVS、TRIFF、MyD88、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17、IFN-α、IFN-β、IFN-γ）的质粒标准品。

1.7 敏感性试验

将IFIT5、PKR和OASL基因的质粒标准品做10倍梯度稀释，分别进行Q-PCR扩增，检测Q-PCR方法的敏感性。

1.8 重复性试验

取5个浓度梯度的各质粒标准品为模板分别进行Q-PCR，试验设3个重复，计算Ct值的变异系数，检测批内重复性；然后，以5个浓度梯度的各质粒标准品为模板隔天重复进行3次Q-PCR，计算Ct值的变异系数，检测批间重复性。

1.9 Q-PCR方法检测病毒感染鸡胚IFIT5、PKR和OASL表达水平的变化

11日龄的SPF鸡胚8枚，收集其中4枚的尿囊液各1mL，合并为一份检测样品（0h）。另外4枚鸡胚经尿囊腔途径接种Duck/China/SDO3/2009各0.2mL。在病毒接种后24h收集尿囊液各1mL，合并作为第二份检测样品（24h）。Trizol法提取两份样品的总RNA，反转录合成cDNA，使用建立的Q-PCR方法检测样品的IFIT5、PKR和OASL表达水平。每个样品做3个重复。通过相对定量法（2^-△△Ct）计算病毒接种后各基因表达水平的变化。

2 结果与分析

2.1 引物及质粒标准品

优化的引物序列及相应的PCR扩增片段长度见表1。重组质粒中各基因片段的测序结果均与GenBank中参考基因的相应序列100%符合。各质粒的OD₂₆₀/OD₂₈₀范围在1.8～2.0之间，表明其纯度高。质粒的浓度范围为10⁹～10¹¹个拷贝/μL。

2.2 Q-PCR体系、循环参数及结果判定

优化的Q-PCR反应体系（20μL）和反应条件如下：Q-PCR Master Mix 10μL，Q-PCR Buff-er 2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板DNA2μL，双蒸水4μL。反应程序均为：95℃预变性2.5min；95℃7s，55℃10s，72℃15s扩增45个循环，每个循环结束时检测荧光；熔解曲线分析为95℃15s，60℃50s，95℃continuous；最后37℃30s结束。

调整荧光定量PCR的扩增基线和阈值设定，以阈值线不低于正常阴性对照扩增曲线的最高点为准。在阳性对照（质粒标准品）为有效扩增、无模板对照（Non-template control，NTC）无扩增的前提下，读取待测样品的Ct值进行结果判定：Ct值大于40的样本为阴性结果；Ct值小于或等于40的样本为阳性结果。

2.3 Q-PCR的标准曲线及回归方程

各基因在广泛的浓度范围内均表现为明显的指数扩增。由图1可见，浓度梯度为7.5×（10～10⁸）个拷贝的Ch-IFIT5基因，其Q-PCR的Ct值在8.99～34.65之间，回归方程为Y=-3.676X+42.32；浓度梯度为5.0×（10～10⁸）个拷贝的Ch-PKR基因，其反应的Ct值在9.51～34.27之间，回归方程：Y=-3.559X+40.28；浓度梯度为2.0×（10²～10⁸）个拷贝的Ch-OASL基因，Q-PCR的Ct值在7.66～30.07之间，回归方程为Y=-3.875X+40.10。

2.4 特异性检测

鸡IFIT5、PKR与OASL基因Q-PCR扩增产物的熔解曲线均为单一峰值（图2）。此外，这3种基因的引物对13种与天然免疫相关的对照基因均无Q-PCR扩增，表明本研究建立的Q-PCR方法的特异性强。

2.5 灵敏度试验

当使用建立的Q-PCR方法分别检测8个、5个和2个拷贝的IFIT5、PKR和OASL基因时，反应的Ct平均值分别为37.48、37.65和36.82，表明该Q-PCR方法具有很高的检测灵敏度。

2.6 重复性试验

批内和批间重复试验的结果表明，Q-PCR检测3种基因的质粒样品时，其Ct值的变异系数均在合理范围内（5%），表明方法的重复性好。

2.7 Q-PCR方法用于鸡IFIT5、PKR和OASL基因检测

鸡胚尿囊液样品中3个抗病毒蛋白基因表达水平的Q-PCR检测结果见表2。在NDV病毒感染后24 h，PKR、OASL和IFIT5的表达水平分别比病毒接种前高出5.03、2.04倍和5.24倍，表明鸡体迅速启动了抗病毒免疫反应，以对抗病毒的感染。

3 讨论与结论

抗病毒蛋白是动物机体抵抗病毒感染的效应物质，因此，相比检测干扰素或细胞因子的表达水平，对鸡体抗病毒蛋白进行检测更能够直接地反映鸡体的抗病毒免疫水平。本研究建立了检测鸡体三种抗病毒蛋白PKR、OASL和IFIT5基因转录水平的SYBR Green I荧光定量PCR方法，可用于检测病毒感染或者疫苗、药物作用后鸡体免疫系统的应答变化，从而有助于阐明病毒的致病机制，在鸡用新型疫苗、免疫增强剂以及抗病毒药物的研究与开发中发挥作用。

本研究建立的方法具有灵敏度高、特异性强、检测线性浓度范围广、重复性好、操作简便及省时等优点，可用于相应基因的绝对或相对定量检测。应用该方法，成功检测到新城疫病毒感染鸡胚后尿囊液中PKR、OASL和IFIT5基因表达上调。