高效降酚菌株GY8培养基的优化

吕建华+李宏+薛智权

摘 要：通过在无机盐培养基中额外添加碳氮源，研究不同碳氮源对热带假丝酵母菌株GY8降酚性能的影响，从而对该菌株培养基进行优化。结果表明，通过添加额外的碳源和氮源均可促进热带假丝酵母菌株GY8的生长。采用的不同碳源中，最适碳源为甲醇，其最适浓度为4 g·L-1。采用的不同氮源中，有机氮源比无机氮源更加有利于热带假丝酵母菌株GY8对苯酚的降解。有机氮源中，酵母膏比蛋白胨更有益于菌株GY8对苯酚的降解，其最适浓度为0.5 g·L-1。

关键词：热带假丝酵母；苯酚和酚类化合物；生物降解

中图分类号：Q93 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.09.009

Abstract：In this paper， the optimum medium condition for phenol degradation property of Candida tropicalis GY8 was investigated by augmenting the inorganic salt medium with different carbon and nitrogen sources. The results showed that additional carbon and nitrogen sources in medium can promote Candida tropicalis GY8 growth. Among the different carbon sources， the optimum carbon source was methanol， and the optimum concentration was 4 g·L-1. The organic nitrogen sources were significantly conductive than inorganic nitrogen sources to Candida tropicalis GY8 removing phenol. Moreover， yeast extracted had better effect on GY8 to degrade phenol than peptoneamong organic nitrogen sources. 0.5 g·L-1of yeast extracted was optimum for maximum phenol removal.

Key words： Candida tropicalis； phenol and phenolic compounds； biodegradation

由于芳香族化合物的毒性及其所致疾病的难治性，其生物降解受到了许多行业研究人员的高度重视。苯酚作为最常见的芳香族化合物之一，广泛存在于诸如煤气化、焦炭生产、医药、农药、肥料、染料制造、化学合成、纸浆和造纸等行业的废水中，其含量可以高达6 g·L-1 [1-2]。高浓度的苯酚已被用作一般的消毒剂，对生物有机体有毒。1 mg·L-1或以上浓度的苯酚就会对水生生物造成影响。即使在相对低浓度的情况下，其对微生物也具有毒性（特别是未驯化的微生物）。另外，苯酚可对将它作为生长底物进行代谢的那些物种产生生长抑制[3]。

微生物分解有机物一般利用有机污染物作为碳源，但同时也需要其他的营养物质，如氮源、能源、无机盐和水。研究表明，某些异生物质化合物的降解率可以通过增加额外的碳源或其他营养化合物如氮气、磷酸盐以及矿物成分等而得到提高。一些常规的碳源，如葡萄糖、谷氨酸钠和酵母提取物等已被用于促进对有毒化学品的降解[4-9]。Yu 和 Ward[10]报道，五氯苯酚（PCP）的降解速率和降解程度在加入葡萄糖和蛋白胨后均显著增加。Topp和Hanson[11]发现，葡萄糖可刺激细胞活力和五氯苯酚的降解。Kotresha和Vidyasagar[12]报道，低浓度的葡萄糖和蛋白胨可以增强绿脓假单胞菌对苯酚的降解。这些结果表明，加入一些常规的碳源和氮源可以帮助减少异生物质对细胞的毒性和生长抑制，从而增加异生物质的转化率。另外，常规碳源还可以为有机化合物的降解提供还原力[13]，或在某些情况下，作为生物降解酶的诱导剂[7]。

目前，在城市污水生物脱氮处理中，经常需要额外添加碳源。甲醇、乙酸钠是最常用的外加碳源[14]。在本研究中，利用各种碳源和氮源营养介质对高效降酚真菌GY8进行生物刺激，以找出最佳的营养源，协同降解苯酚，从而为GY8菌治理含酚废水提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株来源 降解苯酚菌株Candida tropicalis GY8筛选自山西省太谷县污水处理厂曝气池的污水样品，由本实验组保存。

1.1.2 培养基 PDA 固体培养基（g·L-1）：葡萄糖20，马铃薯浸粉3，琼脂粉15，pH值自然，121 ℃，高压灭菌20 min，冷却后加入终浓度为0.025 g·L-1的氯霉素。

PDB培养基（g·L-1）：蛋白胨10，马铃薯粉5，葡萄糖15，NaCl 5，pH值自然，121 ℃，高压灭菌20 min，冷却后加入终浓度为0.025 g·L-1的氯霉素。

无机盐培养基（g·L-1）：K2HPO4 0.4，KH2PO4 0.2，NaCl 0.1，MgSO4 0.1，MnSO4·H2O 0.01，Na2MoO4·2H2O 0.01，（NH4）2SO4 0.4，加水定容，121 ℃，高压灭菌20 min，冷却后加入终浓度为0.025 g·L-1的氯霉素，苯酚根据需要量加入。

1.2 方 法

1.2.1 菌株Candida tropicalisGY8活化 将保存菌株GY8在PDA固体培养基上划线，28 ℃恒温培养箱培养3 d。从PDA培养板挑取活化的单克隆菌，接种到灭菌的含PDB培养基的试管中，28 ℃，150 r·min-1，培养2 d后作为后续试验使用菌株。

1.2.2 不同碳源对菌株GY8降酚性能的影响 在无机盐培养基中分别加入碳原子含量相同的葡萄糖、甲醇和乙酸钠作为培养基的碳源，培养基中的苯酚浓度为1.0 g·L-1。在恒温振荡培养箱（150 r·min-1，28 ℃）中培养8，24，48 h，用4-氨基安替比林分光光度法测定苯酚浓度[15]，计算苯酚降解率。苯酚降解率=（未接种前培养液中苯酚含量-培养结束残余苯酚含量）/未接种前培养液苯酚含量×100%。用分光光度计于600 nm处测定48 h的光吸收度值，表示该菌体生长量，确定最适碳源。

1.2.3 不同氮源对菌株GY8降酚性能的影响 无机盐培养基中的氮源分别用与原培养基氮含量相同的氯化铵、蛋白胨和酵母膏替代，培养基中的苯酚浓度为1.0 g·L-1。在恒温振荡培养箱（150 r·min-1，28 ℃）中培养8，24，48 h，测定苯酚降解率和48 h的菌体生长量，方法同1.2.2，确定最适氮源。

1.2.4 不同浓度的最适碳源对菌株GY8降酚性能的影响 根据1.2.2的试验结果，在无机盐培养基中分别加入碳含量为4，8，12，16 g·L-1甲醇作为培养基的碳源，培养基中的苯酚浓度为1.0 g·L-1。在恒温振荡培养箱（150 r·min-1，28 ℃）中培养8，24，48 h，测定苯酚降解率和48 h的菌体生长量，方法同1.2.2，确定最适碳源的最佳浓度。

1.2.5 不同浓度的最适氮源对GY8菌株降酚性能的影响 根据1.2.3的试验结果，在无机盐培养基中分别添加0.5，1，2，5，10 g·L-1的酵母膏作为氮源，培养基中的苯酚浓度为1.0 g·L-1。在恒温振荡培养箱（150 r·min-1，28 ℃）中培养8，24， 48 h，测定苯酚降解率和48 h的菌体生长量，方法同1.2.2，确定最适氮源的最佳浓度。

2 结果与讨论

2.1 不同碳源对菌株GY8降酚性能的影响

在无机盐培养基中分别以葡萄糖、甲醇和乙酸钠作为培养基的碳源，培养基中的苯酚浓度为1.0 g·L-1。在恒温振荡培养箱（150 r·min-1，28 ℃）中培养8，24，48 h，不同碳源对GY8菌株降酚性能的影响如图1和图2。

从图1可以看出，培养48 h后，4种培养基中菌体浓度都在增长，其中，加乙酸钠的培养基中菌体增长最多，其次为甲醇、葡萄糖，无外加碳源的培养基中菌体增长最少。该结果表明，外加碳源均可以促进微生物的生长。

从图2可以看出，培养8，24 ，48 h后，碳源为甲醇时培养基中的菌对苯酚降解速度最快，当碳源为葡萄糖或乙酸钠时，在培养8 h时对GY8菌降解苯酚有一定的促进作用，但在培养24和48 h后，对GY8菌降解苯酚具有抑制作用。这可能是由于在培养初期，葡萄糖和乙酸钠可以增强GY8菌对苯酚毒性的抵抗性，增加微生物的活性，从而提高对毒害有机物质的处理效果[16-17]。KaiChee和Wang研究发现，在培养基中补充葡萄糖后，培养基pH值由7.2降至4.3，从而导致4-氯酚降解率降低。当在葡萄糖存在时，通过调节培养基的pH值，可以增强苯酚和4-氯酚降解率，并且可实现苯酚和4-氯酚的完全降解[18]。本研究在培养后期，GY8菌可能会代谢葡萄糖和乙酸钠产生酸性物质使培养基pH值降低[19]，抑制苯酚降解酶的活性。图2的结果表明，甲醇对于GY8菌株生长是最有利的，因而增强了菌株对苯酚的降解能力，因此是最佳的碳源。

2.2 不同氮源对菌株GY8降酚性能的影响

无机盐培养基中的氮源分别用与原培养基氮含量相同的氯化铵、蛋白胨和酵母膏替代，培养基中的苯酚浓度为1.0 g·L-1。在恒温振荡培养箱（150 r·min-1，28 ℃）中培养8，24，48 h，不同氮源对GY8菌株降酚性能的影响如图3和图4所示。

由图3和图4可以看出，无机盐培养基中不同的氮源会明显影响到菌株的生长以及苯酚的最终降解率。其中，当无机盐培养基中氮源为酵母膏时，GY8菌株的生长速度及对苯酚的降解效果最佳，蛋白胨次之，然后是硫酸铵和氯化铵。该结果说明，有机氮源对于菌株的生长及苯酚的降解均优于无机氮源。在有机氮源中，由于酵母膏含有谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、麦角甾醇等生长刺激因子，因而可促进菌株生长，而蛋白胨可能会抑制菌株苯酚降解酶分泌[20-22]，故酵母膏对菌株降解苯酚的效率优于蛋白胨。

2.3 不同浓度的最适碳源对菌株GY8降酚性能的影响

在无机盐培养基中分别加入碳含量为4，8，12，16 g·L-1甲醇作为培养基的碳源，培养基中的苯酚浓度为1.0 g·L-1，在恒温振荡培养箱（150 r·min-1，28 ℃）中培养8，24，48 h，不同含量的最适碳源对GY8菌株降酚性能的影响如图5和图6。

由图5可以看出，培养48 h后，4种培养基中菌体浓度都在增长，其中，甲醇浓度为4 g·L-1和8 g·L-1的样品菌体增长较多，两组增长情况无显著差异；甲醇浓度为12 g·L-1和16 g·L-1的样品菌体增长较少，两组增长情况无显著差异。

从图6可以看出，甲醇浓度为4 g·L-1的样品中的菌降解速度最快，随着甲醇浓度升高，GY8降解苯酚的速率依次降低，这可能是随着外加碳源浓度的加大，菌株会优先利用外加碳源，从而对苯酚的利用降低。另外，高浓度甲醇可能会对菌产生毒性作用，从而抑制菌株的生长[23]。

2.4 不同浓度的最适氮源对菌株GY8降酚性能的影响

在无机盐培养基中分别加入氮含量为0.5，1，2，5，10 g·L-1酵母膏作为培养基的氮源，培养基中的苯酚浓度为1.0 g·L-1，在恒温振荡培养箱（150 r·min-1，28 ℃）中培养8，24，48 h，不同含量的最适氮源对GY8菌株降酚性能的影响如图7和图8所示。

由图7可以看出，无论酵母膏的浓度是多大，都会促进该菌的生长。从图8可以看出，不同浓度的酵母膏对苯酚的降解率是有一定影响的，酵母膏浓度越高，苯酚降解率越低，当酵母膏的浓度为0.5 g·L-1时，苯酚降解率达到最大值。该结果表明，低浓度的氮源更利于苯酚的降解。

3 结 论

本试验通过在培养基中添加不同的碳氮源，观察热带假丝酵母菌株GY8的降酚活性，来确定该菌株的最适碳源和氮源。结果表明，通过添加额外的碳源和氮源均可以促进菌株GY8的生长。不同碳源中，最适碳源为甲醇，甲醇浓度为4 g·L-1时，苯酚降解率最大。不同氮源中，有机氮源比无机氮源更有利于热带假丝酵母菌株GY8对苯酚的降解，而有机氮源中酵母膏的效果优于蛋白胨。酵母膏浓度为0.5 g·L-1时，苯酚降解率达到最大。本研究为将GY8菌株应用于含酚废水的治理提供了理论基础。

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