大蒜与烤烟轮作对烟草黑胫病的防治效果及作用机理初探

钏有聪，张立猛，焦永鸽，罗丽芬，方玉婷，廖静静，计思贵，朱书生，杨敏

1云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室，云南生物资源保护与利用国家重点实验室，昆明650201；

2 云南省烟草公司玉溪市公司，玉溪 653100；

3 云南省烟草公司昭通市鲁甸县分公司，鲁甸657100

大蒜与烤烟轮作对烟草黑胫病的防治效果及作用机理初探

钏有聪1，张立猛2，焦永鸽2，罗丽芬1，方玉婷3，廖静静1，计思贵2，朱书生1，杨敏1

1云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室，云南生物资源保护与利用国家重点实验室，昆明650201；

2 云南省烟草公司玉溪市公司，玉溪 653100；

3 云南省烟草公司昭通市鲁甸县分公司，鲁甸657100

为探讨大蒜和烤烟轮作对烟草黑胫病的防治效果，本试验研究了大蒜根系分泌物及主要成分对烟草黑胫病菌的影响。结果表明，大蒜根系分泌物能显著抑制游动孢子的游动及休止孢的萌发；大蒜根系分泌物中的苯并噻唑和2种含硫化合物二烯丙基二硫醚、烯丙基甲基二硫醚对烟草黑胫病菌菌丝生长均具有较强的抑菌活性，其抑制活性均随着供试浓度增加而增强。从而证实：大蒜和烤烟轮作可以通过大蒜的根系分泌抑菌物降低烟草黑胫病的发生和危害，实现病害的生态防控。

大蒜；烟草黑胫病；作物轮作；根系分泌物质

烟草黑胫病是危害烟草的一种毁灭性土传病害，由烟草寄生疫霉（Phytophthoraparasiticavar.nicotianae）侵染引起，是世界烟草生产上危害最严重的病害之一，我国各烟叶主产区都有发生[1]。随着烟田连作年限的延长和连作面积的扩大，该病害的发生呈逐年加重的趋势[2]。我国平均每年因烟草黑胫病造成的经济损失高达1亿元以上[3]。

轮作和间作是减轻土传病害危害的有效措施之一。轮作和间作除了使病原菌失去寄主和增加根际有益微生物的种类和数量外[4-5]，还能通过轮作作物挥发或分泌的抑菌物质抑制土壤中的病原菌。万寿菊与番茄间作可明显降低番茄枯萎病菌孢子萌发率[6]。烟草和水稻水旱轮作可明显降低烟草黑胫病的发病率[7]。烟草和玉米、水稻轮作可以减少烟草青枯病的发生[8]。

大蒜与其它作物套作或轮作能有效控制土传病害[9-10]。大蒜与瓜类轮作辅以休耕可以明显减轻瓜类枯萎病的危害[9]；大棚番茄套种大蒜可以抑制番茄根结线虫病的发生[11]；烟田套种大蒜能明显降低土壤中青枯病菌和黑胫病菌的数量，增加有益放线菌的数量[12]；这可能与大蒜释放的化感物质有关。植物化感物质可以通过多种方式进入土壤中，通过抑制病原菌，调节土壤微生物群落结构来达到控制土传病害的效果[13-14]。大蒜浸提液和挥发物对多种土传病原菌具有明显的抑制活性[15-17]；大蒜根系分泌物可明显抑制瓜类枯萎病菌菌丝生长和孢子萌发[18]。大蒜浸提液和根系分泌物的成分分析结果显示，在浸提液中主要含有包括大蒜素、阿霍烯、硫醚在内的18种抑菌成分[19-20]；在根系分泌物中含有2,6-二异丙基苯酚、2,6-二叔丁基对甲酚和二烯丙基二硫醚等化感物质[21]。课题组前期GC-MS和HPLC检测结果表明，大蒜的根系分泌物中主要含有苯并噻唑（BZO）及3种含硫化合物二烯丙基二硫醚（DADS）、烯丙基甲基二硫醚（MADS）和1-丙烯基甲基二硫醚（MPDS）等物质(另文报道)，但根系分泌物中的抑菌成分及其对烟草主要病害烟草黑胫病菌的抑制活性目前未见报道。

本文研究了利用大蒜与烤烟轮作对烟草黑胫病的控制效果，并深入分析大蒜根系分泌物及其中的含硫化合物对烟草黑胫病菌的抑菌活性，明确大蒜与烤烟轮作控制烟草黑胫病的化感原理，以期为利用大蒜轮作控制作物病害提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点

田间试验于2012—2015 年在云南省玉溪市烟草公司赵桅试验基地（24.497 °N, 24.317 °E）进行。试验烟田为砂壤土，是烟草黑胫病重发病田块，前茬作物为烟草，烟草收获后种植大蒜。

1.2 试验材料

烟苗（KRK26 品种）由云南省玉溪烟草公司提供，该品种对烟草黑胫病高度感病。大蒜（Allium sativumL.，呈贡白蒜）购于市场，于移栽前10 d 放于室内让其自然露芽备用。烟草黑胫病菌烟草寄生疫霉（Phytophthoraparasiticavar.nicotianae）由本实验室分离自田间发病植株。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂16 g，加水定容至1 L。番茄燕麦培养基：燕麦200 g、番茄汁150 mL、琼脂16 g，加水定容至1 L。供试化合物：苯并噻唑（BZO，纯度97%）、二烯丙基二硫醚（DADS，纯度80%）购自Alfa Aesar化学有限公司。烯丙基甲基二硫醚（MADS，纯度95%）购自南京康满林化工实业有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 大蒜与烤烟轮作控制烟草黑胫病的田间试验

田间设置2个处理：（1）烟草与大蒜轮作。烟草5月移栽，10月采收结束；烟草收获后种植大蒜，（株距10 cm，行距15 cm）第二年的4月收获，大蒜收获后5月再移栽烟草。（2）烟草连作。烟草5月种植，10月收获，收获后休耕，第二年5月再种植烟草。田间按随机区组设计，重复3 次，每一重复小区面积为200 m2。田间管理措施按当地优质烟叶栽培技术规程进行。

1.3.2 大蒜根系分泌物的收集

大蒜根系分泌物的收集参照刘屹湘[22]的方法进行。将颗粒饱满，大小一致的蒜瓣表面消毒后进行4℃低温催芽处理，选择出芽长度一致的蒜瓣播入根系分泌物连续收集装置无底玻璃瓶中的石英砂内进行培养，20 d后进行根系分泌物的收集。循环收集大蒜的根系分泌物3 d，取下树脂填充柱，用甲醇洗脱树脂4次，收集洗脱液，使用旋转蒸发仪进行减压浓缩，除去洗脱液中的甲醇；去甲醇后的洗脱液在pH5.5～6.0的条件下与二氯甲烷以1∶2的比例进行萃取，重复3次，将萃取液通过无水CaCO3除水，用旋转蒸发仪减压浓缩至干，用甲醇溶解成浓度为10 mg/mL的母液，过0.45 μm有机滤膜，4 ℃冰箱低温避光保存备用。

1.3.3 烟草黑胫病菌游动孢子悬浮液和休止孢悬浮液的制备

用打孔器沿生长4 d的菌落边缘打取直径为0.5 cm菌饼，产孢时将烟草黑胫病菌接种于番茄燕麦培养基上25 ℃黑暗培养7 d至菌丝繁茂后刮取菌丝，将菌丝在无菌水中25 ℃光照培养3～4 d后即产生孢子囊，用无菌水将孢子囊洗脱，将产孢的菌丝更换无菌水后于4 ℃冰箱放置20 min进行冷刺激，然后室温放置15 min释放游动孢子，再用血球计数板将游动孢子悬浮液浓度调至105个孢子/mL备用。将游动孢子悬浮液涡旋震荡10 min使其鞭毛脱落，制成105个孢子/mL的休止孢悬浮液备用。

1.3.4 大蒜根系分泌物对烟草黑胫病菌游动孢子游动和休止孢萌发的影响

用无菌水将根系分泌物母液梯度稀释50、250、500、5000倍，制成终浓度为0.2、0.04、0.02、0.002 mg/mL的稀释液，以含有最高甲醇含量的无菌水为对照。取游动孢子悬浮液、休止孢悬浮液各20 µL分别与不同浓度的根系分泌物各20 µL在凹玻片上混匀，20 ℃黑暗保湿培养。培养1、5、20、40、60、80、100、120 min后观察游动孢子休止的比例，每一重复观察5个视野，每一视野计数100个游动孢子中休止的个数，计算休止率。培养一段时间后待对照的休止孢萌发率达到85%以上时计数观察休止孢萌发的数量，计算100个休止孢的萌发率。每一处理设置4次重复。

1.3.5 根系分泌物中化合物对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制活性

课题组前期抑菌活性筛选的试验结果显示，1-丙烯基甲基二硫醚（MPDS）对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制活性低，因此本试验选取了大蒜根系分泌物中的1种苯并噻唑类化合物（BZO）和除MPDS 之外的2种含硫化合物（DADS和MADS）来进行抑菌活性的深入研究。用甲醇将以上化合物制成浓度为105mg/L母液，按照体积比1∶100的比例分别加入已冷却至50 ℃左右的PDA培养基中，充分混匀后倒入灭菌的培养皿（直径90 mm），制成终浓度为10、100、200、300 mg/L（BZO） 和 200、500、800、1000 mg/L（DADS和MADS）的带药平板；以加入等体积甲醇的PDA平板为对照。沿生长4 d的菌落边缘打取菌饼（直径0.5 cm），将菌饼接种于培养基中央，于25 ℃恒温培养箱内黑暗培养。每处理设置4次重复，待对照处理中菌落直径长至培养皿的2/3左右，采用“十字交叉法”测量菌落直径。按照以下公式计算不同浓度化合物对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制率。抑制率（%）=（对照菌落平均直径－各处理菌落平均直径）/对照菌落平均直径×100 %。

1.3.6 数据分析

试验数据采用 Excel 2003及SPSS 18.0软件进行统计分析，采用Duncan氏新复极差法和t检验进行差异显著性分析。

2 结果分析

2.1 大蒜与烟草轮作对烟草黑胫病的控制效果

2012—2015连续4年的田间试验结果表明，大蒜与烟草轮作可以明显降低田间烟草黑胫病的发生，增加烟草产量(图1)。2012年试验之初，用于大蒜-烟草轮作田块的发病率明显高于烟草连作田，2013年实行轮作后轮作田块的发病率明显降低，与连作田差异不明显，随着连作时间延长，2014—2015年烟草-大蒜轮作田的发病率显著低于连作田。这表明大蒜和烟草轮作可以明显降低田间烟草黑胫病的发生危害。轮作还可以明显提高烟草的产量，随着轮作时间的增加，烟草产量显著提高，而连作处理中产量变化不大。

图1 大蒜与烟草不同轮作模式对烟草黑胫病的防治效果及对产量的影响Fig.1 Control effects of tobacco and garlic with different rotation patterns on tobacco black shank and its effect on yield

2.2 大蒜根系分泌物对烟草黑胫病菌游动孢子和休止孢的抑制活性

黑胫病菌游动孢子和休止孢的抑制试验结果表明（表1），大蒜根系分泌物对烟草黑胫病菌游动孢子游动的抑制活性随供试浓度增加而增强。在低浓度（0.001 mg/mL和0.01 mg/mL）时，在观察的时间内未出现全部休止的现象，但随着处理时间延长游动孢子休止的比例有所增加。在浓度为0.02 mg/mL时，根系分泌物处理游动孢子60 min后就可观察到70 %以上的游动孢子出现休止，到120 min后全部休止；当浓度升高至0.1 mg/mL时，游动孢子在处理5 min后开始出现大量的休止孢，到20 min时游动孢子全部休止。而对照在观察的时间段内仍有70 %以上的游动孢子未出现休止。大蒜根系分泌物对烟草黑胫病菌休止孢的萌发有显著的抑制活性，且抑制作用随浓度增加而增强，在浓度为0.1 mg/mL时的抑制率可达69.67 % (表 2)。

表1 大蒜根系分泌物对烟草黑胫病菌游动孢子游动的影响Tab.1 Effect of garlic root exudates on the swimming of zoospores of Phytophthora parasitica

表2 大蒜根系分泌物对烟草黑胫病菌休止孢萌发的影响Tab. 2 Effect of garlic root exudates on the germination of cystospore of Phytophthora parasitica

2.3 大蒜根系分泌物中化合物对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制活性

烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制试验结果表明，大蒜中的苯并噻唑（BZO）及含硫化合物二烯丙基二硫醚（DADS）和烯丙基甲基二硫醚（MADS）对烟草黑胫病菌菌丝生长均具有较强的抑菌活性，且抑制活性随着供试浓度增加而增强。与含硫化合物相比，苯并噻唑可以在更低的浓度下明显抑制菌丝生长，在300 mg/L浓度时抑制率可以达到73.19 %（图2）。DADS在供试浓度下对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制率在21.44 %～88.36 %（图3），MADS在供试浓度下对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制率在47.14 %～92.98 %（图4）。在供试最高浓度1000 mg/L浓度下，含硫化合物DADS和MADS可以显著抑制烟草黑胫病菌菌丝生长。

图2 大蒜根系分泌化合物BZO对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制活性Fig.2 Inhibitory activity of garlic root exudate BZO on the mycelium growth of Phytophthora parasitica

图3 大蒜根系分泌化合物DADS对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制活性Fig.3 Inhibitory activity of garlic root exudate DADS on the mycelium growth of Phytophthora parasitica

图4 大蒜根系分泌化合物MADS对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制活性Fig.4 Inhibitory activity of garlic root exudate MADS on the mycelium growth of Phytophthora parasitica

3 讨论

利用作物轮作控制土传病害的研究由来已久，许多植物在生长的过程中会通过挥发、根系分泌或地上部淋溶[4,23]等方式释放一些物质对周围的植物或微生物产生影响[5,10]。本研究结果表明，利用大蒜和烟草轮作可以有效减轻烟草黑胫病的发生和危害，提高烟草产量。但由于田间病害发生受气候影响较大，不同年份间发病情况存在较大差异，也导致大蒜与烟草轮作的防病效果在试验的后几年差异不明显。但是轮作处理显著提高了烟草的产量，这可能是由于烟草和大蒜轮作降低黑胫病危害，减少了黑胫病对病害造成的损失。

生产实践表明，利用葱属植物轮作或间作是减轻土传病害的有效方法之一[9]。已有研究表明，大蒜浸提液对辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、早疫病菌（Alternaria solani）、丝核菌（Rhizoctonia spp.）、灰霉菌（Botrytis cinerea）、白粉病菌（Erysiphe pisi）和核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）孢子萌发和菌丝生长均具有较强的抑制活性[15-16,26-30]。这与大蒜浸提液中含有大量的大蒜素及其降解的含硫化合物有关[19,31]。大蒜素不稳定，会降解成多种含硫化合物，包括二烯丙基一硫化物（DAS）、二烯丙基二硫化物（DADS）、二烯丙基三硫化物（DATS）、二甲基三硫化物（DMTS）、3-乙烯基-1,2-二硫杂-4-环己烯、3-乙烯基-1,2-二硫杂-5-环己烯和二甲基二硫醚[15]等。而这些具有抑菌活性的含硫化合物可以通过大蒜根系分泌到土壤中发挥抑菌活性从而减轻烟草黑胫病的危害。

根系分泌物是植物与土壤进行物质交换的重要载体物质,植物可以通过根系分泌物对根际微生物产生影响[5,10]。已有研究表明，玉米根系可以将辣椒疫霉菌游动孢子吸附在根际，然后分泌出一些苯并噁嗪类抑菌物质（如丁布等）抑制休止孢的萌发并使其裂解，从而阻隔游动孢子在辣椒行间的传播，有效控制辣椒疫病的蔓延[32]。本实验结果表明，大蒜根系分泌物在短时间内可以使游动孢子迅速休止并显著抑制其萌发侵染。大蒜和烟草轮作可明显降低烟草黑胫病的发生危害可能也与大蒜根系分泌的抑菌物质及其对烟草黑胫病菌孢子侵染行为的干扰有关。

本研究证实了大蒜根系分泌物中的含硫化合物二烯丙基二硫醚（DADS）和烯丙基甲基二硫醚（MADS）及苯并噻唑（BZO）对烟草黑胫病菌菌丝生长均具有较强的抑菌活性。已有研究显示，葱属作物产生的含硫化合物能够氧化巯基，这可以使与微生物生长繁殖有关的含硫巯基酶失活，或对含硫氧基的化合物如肌氨酸、谷氨酸等产生竞争性抑制，又或对某些酶的活性产生非竞争性抑制，从而对众多病原菌起到抑制或杀灭作用[33-37]。苯并噻唑广泛存在于玉米根系分泌物、洋葱、龙须眼子菜、苹果和大米中[38-40]，且对多种植物病原真菌和卵菌均具有较强的抑制活性[41]。

植物根系还可以分泌多种物质吸引微生物在根际聚集。大豆连作3年以上，真菌数量增加，重茬较正茬真菌增加18.0 %～35.5 %，且以青霉菌、镰刀菌和立枯丝核菌占多数[42]；玉米生长活动及根系代谢产物对土壤细菌、真菌和放线菌数量的增加有促进作用[43]。本试验中发现大蒜和烟草轮作后，轮作处理中烟草的产量逐年增加，这可能与轮作处理改善了土壤物理结构或改变了根际微生物群落有关，但还需后续相关试验进行证实。

4 结论

大蒜和烟草轮作可以减轻田间烟草黑胫病的发生危害，并显著提高烟草产量。大蒜根系分泌物可以干扰烟草黑胫病菌孢子在土壤中的传播侵染行为，并能分泌苯并噻唑和多种含硫化合物抑制烟草黑胫病菌菌丝的生长。生产上可以利用大蒜和烟草轮作有效降低烟草黑胫病在田间的传播危害，有利于克服目前化学农药的环境污染和抗药性问题，实现病害的生态防控。

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Control effects of tobacco and garlic rotation on tobacco black shank and a preliminary study on the inhibition mechanism

CHUAN Youcong1, ZHANG Limeng2, JIAO Yongge2, LUO Lifen1, FANG Yuting3,LIAO Jingjing1, JI Sigui2, ZHU Shusheng1, YANG Min1
1 Key Laboratory for Agro-biodiversity and Pest Control of Ministry of Education; State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-Resources in Yunnan, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China;
2 Yunnan Yuxi Municipal Tobacco Company, Yuxi 653100, Yunnan, China;
3 Yunnan Ludian County Tobacco Company, Ludian 657100, Yunnan, China

Control effects of tobacco and garlic (Allium sativum)rotation on tobacco black shank for four consecutive years were monitored and the antimicrobial activity of garlic root exudates and its contained compounds againstPhytophthora parasiticavar.nicotianaewere analyzed. Results demonstrated that incidence of tobacco black shank was significantly reduced after rotation with garlic,and tobacco production was also significantly improved. Root exudates secreted by garlic could inhibit zoospore motility and cystospore germination. Benzothiazole, diallyl disulfide ether and methyl allyl disulfide ether, contained in the root exudates ofA. sativum, showed strong inhibitory activity against mycelium growth of P.parasiticavar.nicotianae, and inhibitory activity was dose-dependent. Garlic rotated with tobacco not only effectively control occurrence and damage of tobacco black shank, but also increase tobacco yield, partly due to the antifungal activity ofA. sativumroot exudates, which are useful to achieve ecological control of tobacco diseases.

garlic; tobacco black shank; crop rotation; root exudates

钏有聪，张立猛，焦永鸽，等. 大蒜与烤烟轮作对烟草黑胫病的防治效果及作用机理初探[J]. 中国烟草学报，2016,22（5）

云南省烟草公司科技计划(2012YN42)；云南农业大学自然科学青年基金资助项目（2015ZR01）；云南省科技计划面上项目（2016FB148）。

钏有聪(1990—)，硕士，主要研究方向为生物多样性控制病害， Email：chuanyoucong@163.com；

杨 敏(1981—)，讲师，博士，Tel∶ 0871-65220591，Email：yangminscnc@126.com

2016-05-31

：CHUAN Youcong, ZHANG Limeng, JIAO Yongge, et al. Control effects of tobacco and garlic rotation on tobacco black shank and a preliminary study on the inhibition mechanism [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016, 22(5)