复合有机肥对烤烟淀粉生物合成的影响

杨胜男，张洪映，连文力，牛德新，崔红

河南农业大学烟草学院/国家烟草栽培生理生化基地，河南郑州 450002

复合有机肥对烤烟淀粉生物合成的影响

杨胜男，张洪映，连文力，牛德新，崔红

河南农业大学烟草学院/国家烟草栽培生理生化基地，河南郑州 450002

为探讨复合有机肥（生物炭占30%，草炭占70%）对烤烟烟叶淀粉合成代谢途径的影响，采用田间试验方法，比较不同施用量下烤烟云烟87叶片超微结构差异、淀粉积累规律以及淀粉合成关键酶基因的表达规律。结果表明：添加复合有机肥有利于叶片细胞中淀粉粒的积累，随着施用量的增加，淀粉粒数目增多、体积变大；总淀粉和支链淀粉含量相应增加，直链淀粉含量反而减少，淀粉组分显著改变；淀粉合成关键酶基因的表达变化与淀粉含量变化一致，颗粒结合型淀粉合成酶基因（GBSS1)的表达随复合有机肥的施用量增加而减弱，可溶性淀粉合成酶基因（SS1）的表达随复合有机肥的施用量增加而增强。由此可见复合有机肥可增加淀粉的积累并改变淀粉组分。

烤烟；有机肥；淀粉；淀粉粒超微结构；生物炭和草炭

烟草中淀粉的积累、转化和分解决定着烟叶内在品质和外观商品等级的优劣，烟叶生产中要求叶片在生长发育过程中积累一定量的淀粉，烘烤过程中又要求淀粉尽可能地降解为游离糖类，最终使烟叶化学成分协调，品质提高[1-4]。张松涛等[5]研究发现，云南烟叶中GBSS1基因的转录水平和淀粉合成酶活性显著高于河南，但两者成熟烟叶中淀粉含量无显著差异，烤后样品中淀粉含量却差异显著，推测是由于河南与云南烟叶淀粉组分存在差异。烘烤过程中，淀粉在淀粉分解酶的作用下迅速降解，结构及理化性质如淀粉颗粒形貌、结晶结构、黏度等发生变化，更重要的是淀粉酶的分解作用在不同淀粉体结构之间存在差异[6,7]。因此，淀粉的分子结构和分支特性不同，直链淀粉与支链淀粉比例不同会影响烤后烟叶淀粉含量，甚至是烟叶的质量和风格特色。目前有关烟草淀粉的研究主要集中于烘烤过程中总淀粉的含量变化和淀粉分解酶活性强弱[8,9]，忽视淀粉合成酶活性的变化以及淀粉组分的差异。

淀粉含量高作为难以解决的质量问题[10-12]，一方面与烟叶成熟度和烘烤技术等有关，另一方面与烟叶生长发育过程中直链、支链淀粉的积累及其比值有关。研究表明，遗传因素、生态条件、农艺措施、调制技术及陈化发酵都会影响叶片中淀粉含量[13]。土壤质地疏松，所栽培的烟叶糖分含量都较高[14]；施肥量以及氮肥形态通过影响烟叶中酶的活性来影响碳氮代谢，进而影响碳的固定、转化和积累，烟草生产施肥中要增加一定比例的有机氮源才能获得优质烟叶[15]。同时，淀粉组分配比不同会导致淀粉粒的大小、结构和分解性能等的差异，而且淀粉的水解及酶解程度与直链淀粉的含量成反比，直链淀粉含量高的淀粉具抗酶解性[16,17]。因此，相对于总淀粉含量，直链淀粉与支链淀粉的含量比重及其比值对品质影响的研究更有意义。

施用生物炭可以提高土壤的阳离子交换量，降低土壤容重，增加通气性和土壤持水量，提高肥料养分利用率，促进植物根系生长[18-20]。草炭是富含有机质和腐殖酸的有机肥料，其施入土壤后表现为前期持水保肥力强，后期矿化能力强[21-23]。改变土壤的供肥规律可能会改变直链淀粉的代谢规律，控释氮肥对稻米品质影响的研究发现，施肥处理明显降低了稻米的直链淀粉含量[24]；郑泽荣[25]研究发现，与单施化肥相比，有机肥与化肥混施可以提高小麦淀粉的支/直比例，从而实现对淀粉品质的调控。目前有关生物炭或草炭对烟草影响的报道多集中于烟叶干物质积累、经济性状和品质变化，鲜少从分子水平来评价其对烟草内在发育的影响；本研究以淀粉合成代谢为出发点，采集不同生物炭和草炭用量下的中部烟叶，对其进行淀粉粒超微结构观察、淀粉组分测定和淀粉合成途径相关基因表达水平分析，以期为合理使用有机肥料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试烤烟品种为云烟87。

1.2 试验设计与处理

大田试验于2014年3月至9月在河南南阳金叶园－浓香型特色优质烟叶开发项目产区进行，土壤质地为黄壤土，肥力均匀适中，pH为7.42，土壤有机质含量11.42 g/kg，碱解氮含量57.40 mg/kg，速效磷含量20.12 mg/kg，速效钾含量121.18 mg/kg。供试有机肥由生物炭和草炭组成，其中生物炭为花生壳炭，在400℃无氧条件下热解制成，容重为0.46 g/cm3，氮磷钾含量可忽略。草炭有机质含量59.4%，腐殖酸含量31.5%，全氮1.1%，全磷0.26%，全钾0.17%，容重0.24 g/cm3，产地东北，由河南艾农生物科技有限公司生产。试验前按照生物炭占30%，草炭占70%的比例混合均匀备用。

试验设置三个处理，对照CK依照当地优质烟叶生产进行管理；处理1在对照的基础上施用有机肥3000 kg/hm2(记作T1)；处理2在对照的基础上施用有机肥9000 kg/hm2(记作T2)，移栽前条施施入土壤，各处理面积200 m2，重复三次。各项管理措施与当地最优措施保持一致。

1.3 样品采集

本试验取样在打顶后进行，打顶前所有烟株统一打掉3片脚叶，留叶数保证为22片。采集中部叶(10～12叶位)，第次取样三个处理间叶位一致，第次取样过后标记，已取样的烟株不再取样。打顶当天即移栽后60 d取第一次样品，此时烟叶处于旺长生长后期；随后第隔8 d取一次样品，试验过程中共取样5次，最后一次取样为打顶后32 d即移栽后92 d，此时烟叶达到成熟采收期。各处理选择9株长势一致的烟株，第株取1片烟叶，第3片混合均匀，作为一次重复，烟叶迅速置于液氮中，于-80℃冻存，用于基因表达研究和淀粉含量测定。

1.4 淀粉粒超微结构观察

烟叶组织样取样部位统一为从叶基部数第七和第八支脉之间，在叶片右侧距离主脉3～5 cm处切取1 mm×3 mm叶肉组织，采用5%的戊二醛溶液进行固定，于4℃冰箱内保存。采用透射电镜观察淀粉粒超微结构[26]。

1.5 淀粉含量的测定

采用高氯酸超声萃取－连续流动法测定总淀粉含量[27]。直链淀粉和支链淀粉含量测定采用双波比色法[28]。

1.6 基因表达分析

采用Trizol法提取烟叶总RNA，样品通过随机引物法反转录合成cDNA。根据Genbank发布的ADPG焦磷酸化酶基因(AGPase)、可溶性淀粉合成酶基因(SS1)、颗粒结合型淀粉合成酶基因(GBSS1)、淀粉分支酶基因(SBE)和淀粉去分支酶基因(DBE)的序列设计各基因扩增引物[29]，进行基因表达的半定量PCR检测。以烟草核糖体蛋白编码基因L25[30]作为内参基因，引物由苏州金唯智生物科技公司合成。

表1 PCR扩增基因及引物序列Tab. 1 Genbank accession number and primer sequence

PCR体系：cDNA为1 μL，上游引物和下游引物（5 μM）均为0.4 μL，2×Taqmix（上海莱枫生物科技）为10 μL，diH2O为8.2 μL。反应程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，退火温度为50℃，时间30s，72℃延伸30 s；30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。

1.7 数据处理和统计方法

试验数据采用DPS 7.05统计软件进行数据分析，由新复极差法分析均值差异的显著性, 显著性水平P＜0 .05，以a、b、c表示其差异性，数字后不含有相同字母表示差异有统计学意义；采用Excel 2013软件绘图制表。

2 结果与分析

2.1 复合有机肥对叶片超微结构的影响

在烟叶成熟过程中，对同一部位、不同时期的叶片取样，进行超微观察，比较叶绿体中淀粉粒的积累规律。结果如图1所示。

图1 烟叶成熟期的淀粉粒超微结构比较（×1000）Fig. 1 Ultrastructure of starch granule of tobacco leaves at maturing stage(×1000)

随着烟叶成熟期的推进，栅栏组织叶绿体中的淀粉粒积累呈现规律性的变化；各处理淀粉粒数目增多、体积增大，到成熟后期淀粉粒降解，分散于细胞内(图1)。具体来看，打顶当天及打顶后8 d，叶片仍处于快速生长时期，烟叶中的叶绿体层结构清晰，已有1～4个被膜清晰、大小不同的淀粉粒，但淀粉粒体积较小、含量较少，各处理差异不大。打顶后16 d内，各处理淀粉粒体积急剧增加，数量增多；T2处理的淀粉粒体积最大，次之为T1。打顶后24 d，叶绿体类囊体开始肿胀，淀粉粒大多发育充盈，T1和T2的淀粉粒体积明显大于对照。打顶后32 d，各处理的叶绿体类囊体片层结构清晰程度下降；T2的淀粉粒游离到细胞内部，降解程度最强。对比三个处理的淀粉超微结构及含量发现，施用生物炭和草炭的中部叶片各发育时期淀粉粒积累水平高于对照，均在打顶后24 d达到最大值。

2.2 复合有机肥对叶片淀粉含量和组分的影响

对不同有机肥施用量下烟叶发育过程中样品的淀粉总含量、直链淀粉和支链淀粉进行测定，结果见图2～4。

图2 不同施肥水平下各时期烟叶中总淀粉含量Fig. 2 The total starch content in tobacco leaves under different application rates of organic mixed fertilizer

图3 不同施肥水平下各时期烟叶中支链淀粉含量Fig. 3 The amylopectin content in tobacco leaves under different application rates of organic mixed fertilizer

图4 不同施肥水平下各时期烟叶中直链淀粉含量Fig. 4 The amylose content in tobacco leaves under different application rates of organic mixed fertilizer

表2 直链淀粉占总淀粉含量的比例Tab. 2 The proportion of the amylose to the total starch content %

成熟期烟叶淀粉含量的测定结果发现：烟叶成熟期淀粉总量逐渐增加，在打顶后24 d达到最高值，此时烟株处于生理成熟期，随后淀粉降解，含量降低；支链淀粉变化趋势与总淀粉一致，与直链淀粉相比提前达到最大值，随后降解幅度较大；直链淀粉同样在打顶后24 d达到最大值，但达到最大值后含量变化较小。

施用复合有机肥后淀粉总量较对照明显升高，其中，T1处理和T2处理的支链淀粉含量较对照明显提高，T2的直链淀粉含量较T1处理和对照明显降低，支链淀粉含量自打顶开始发生较大变化，直链淀粉含量自打顶后8 d开始较大幅度上升；总体来看，打顶后8 d至24 d是各处理间淀粉含量发生变化的关键时期。由表2可知，T2处理下直链淀粉所占比例明显小于对照，T1处理与其相差不大。施用复合有机肥造成直链淀粉降低，支链淀粉明显上升，由此可见，施用复合有机肥可使淀粉组分明显改变且使淀粉的支链/直链比值变大。

2.3 复合有机肥对淀粉合成相关基因表达的影响

为探明不同处理对成熟期烟叶淀粉合成途径中关键基因的影响，通过半定量RT-PCR对ADPG焦磷酸化酶基因(AGPase)、结合型淀粉合成酶基因（GBSS1）、淀粉合成酶基因(SS1)、淀粉分支酶基因(SBE)和淀粉去分支酶基因(DBE)进行转录水平分析。

由图5可知，AGPase在各处理中成熟期烟叶中的表达量无明显变化；GBSS1的表达量随着施肥量的增加逐渐减弱，在同一处理条件下各生育期差异不大；SS1在烟叶成熟期的表达量呈下降趋势，但在T2处理条件下表达量要明显强于对照和T1处理；SBE和DBE的表达量变化趋势相同：在对照的成熟期烟叶中的表达量无明显变化，增施有机肥后表达量呈由弱变强趋势，总体弱于对照的表达量。

图5 不同施用量下淀粉合成关键基因的半定量RT-PCR分析Fig. 5 Expression level of starch biosynthesis-related genes under different application rates of organic mixed fertilizer

3 讨论

土壤是优质烟叶生产的物质基础和环境条件，优质的土壤是优质烟生产的必要前提。碳代谢相关基因和酶活性对土壤条件极其敏感[31,32]，可利用改善土壤营养和物理条件对其进行有效调控，进而提高烟叶品质。本试验设计生物炭和草炭，相互配合，共同调节土壤养分供应，为生产优质烟叶打下良好的生理基础。本试验结果表明，与对照相比，增施生物炭和草炭有利于淀粉在烟叶生理成熟前积累和成熟后分解，各时期的电镜观察结果与此保持一致。随着细胞中淀粉粒体积增大，数量增多，所测得的淀粉含量亦增加，生长后期淀粉粒逐渐降解分散，所测得的淀粉含量相应减少。目前的研究表明，生物炭和草炭均可显著改良土壤，主要表现为增加土壤中有机质的含量，降低土壤容重，提高土壤孔隙度，从而对烟株的根系发育起着极大的促进作用。草炭和生物炭还有一定的区别：草炭本身的肥效释放缓慢，在烟株生育后期有机质矿化能力强，释放出较多的无机氮素，土壤供氮能力增强[33]；施用生物炭可提高土壤C/N比，降低土壤碱解氮的含量，限制土壤氮素的利用度[34]。试验中T2处理淀粉含量前期少后期急剧增加就可能与草炭和生物炭致使土壤供肥能力增加，肥效释放缓慢有关。

在施用量上，本试验中，增施生物炭和草炭明显提高打顶前期烟叶中淀粉含量，同时后期又有利于淀粉的降解，尤以T2处理施用9000 kg/hm2生物炭和草炭混合肥效果更好，这与前人的研究结果表现一致。王树会等[35]利用盆栽试验研究，发现第株烟施用草炭量达到1～2 kg时，烟叶的产量有大幅提高，但对烟叶的品质无影响，同时尚未有报道关于草炭用量对植物生长不利。刘新源等[36]的研究结果发现，施用1125 kg/hm2、1575 kg/hm2的生物炭，淀粉含量较对照增加，施用量增加至2025 kg/hm2、2475 kg/hm2时，淀粉含量反而降低。综合来看，在一定的施用量范围内，生物炭和草炭施用量越多，其保肥蓄水能力表现的越明显，对淀粉的合成和降解影响越大，时间越持久；适宜的生物碳与草碳的配比和施用量应与供试植烟土壤的质地、容重、结构和肥力水平等直接有关，该方面尚待进一步研究。

淀粉降解的内部因素主要有淀粉粒的大小、形状、组成及结构等[37]。本试验对烟叶中的淀粉组分进行测定，比较三个处理的结果发现，T2处理直链淀粉比例最小，降解幅度最大。烟草淀粉粒内部具有结晶区和非结晶区，直链淀粉、支链淀粉分子的侧链都是直链，趋向平行排列，相邻羟基间经氢键结合成散射状结晶性“束”构即结晶区，有一定强度，其余为无定形区[38]。研究表明，随直链淀粉含量比重增加，淀粉颗粒内部无定形区减小，结构致密性增强，更易通过氢键结合形成较为稳固的晶格；一般认为，淀粉的水解及酶解首先发生在支链淀粉所形成的无定形区，结构致密的晶格结构导致水解酶不易发生作用[16,17]。因此，增施有机肥降低直链淀粉含量比例，可能更有利成熟后期烟叶中淀粉的降解，进而对烘烤过程淀粉的降解有一定的影响。

基因表达结果显示AGPase基因的表达在各处理间差异不大，但增施生物炭和草炭后的GBSS1基因的RNA表达水平明显低于对照，说明生长过程中直链淀粉的合成量降低，与所测得的直链淀粉积累量变化相一致。GBSS1作为颗粒结合型淀粉合成酶，紧密结合在淀粉粒上，通过α-1,4糖苷键将ADPG中的葡萄糖基加到葡萄糖链的非还原端，形成线性大分子，因此是直链淀粉合成途径关键基因[39]。可溶性淀粉合成酶是一大类被广泛研究的支链淀粉合成酶，它有多个同工型酶，SS1只是其中一种，具有调控支链淀粉短链合成的作用；SBE和DBE具有合成和分解淀粉的作用，并有两种以上的同工型，因而关于支链淀粉的分支、延伸及共同作用的酶学机理更为复杂[40]。相关研究认为支链淀粉合成是SBE和DBE平衡的结果[41]，这也可能是本试验中SBE和DBE的基因表达量变化趋势相同的原因。

4 结论

试验通过对淀粉粒的超微结构观察以及淀粉总量及组分的测定表明施用复合有机肥有利于淀粉的合成，并造成直链淀粉比重降低，影响淀粉的降解性能；根据不同有机肥施用量对淀粉生物合成的影响，我们认为在该试验条件下，随着复合有机肥用量的升高，更易获得优质烟叶，至于最佳施用量则需进一步设置梯度进行试验。但是本试验重点关注烟叶成熟过程中的淀粉变化，未能采集不同处理的样品进行烘烤和调制，进一步测定其淀粉含量及组分的变化。对于淀粉组分改变是否造成烟叶最终的品质和质量风格特色变化尚需进一步研究。

[1] Severson R F. Cuticular constituents of tobacco factors afftecting their production and their role in insect and disease resistance and smoke quality[J]. Rec Adv Tob Sci,1985(11): 105-168.

[2] Leffingwell J C. Chemical and sensory aspects of tobacco fl avor. An overview[J]. Rec Adv Tob Sci, 1988(14): 169.

[3] 宫长荣, 王能如, 汪耀富. 烟叶烘烤原理[M]. 北京: 科学出版社, 1994: 98-107,131-136.Gong changrong, Wang nengru, Wang yaofu. Tobacco Curing Principle[M]. Beijing:Science Press, 1994: 98-107,131-136. (in Chinese)

[4] 邱妙文, 凌寿军, 王行, 等. 不同烘烤湿度条件与烟叶淀粉含量变化关系[J]. 中国烟草科学, 2004, 25(3): 6-8.Qiu Miaowen, Ling Shoujun, WANG Hang, et al.Relationship beween different curing humidity and the contentvariation of starch in tobacco leaves[J]. Chinese Tobacco Science, 2004, 25(3): 6-8. (in Chinese)

[5] 张松涛, 杨永霞, 滑夏华, 等. 不同生态区烟叶淀粉生物合成动态比较研究[J]. 中国烟草学报, 2012, 18(4): 31-34,40.Zhang Songtao, Yang Yongxia, Hua Xiahua, et al.Comparison of the dynamic metabolism of starch biosynthesis in tobacco leaves from different ecological zones[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2012, 18(4): 31-34, 40. (in Chinese)

[6] 宋朝鹏, 孙福山, 许自成, 等. 烤烟调制过程中淀粉精细结构的研究进展[J], 中国烟草科学, 2010, 31(1): 70-73,78.Song Zhaopeng, Sun Fushan, Xu Zicheng, et al. Research Advance in Fine Structure of Tobacco Starch during Curing[J]. Chinese Tobacco Science, 2010, 31(1): 70-73,78. (in Chinese)

[7] 贺帆, 王涛, 王梅, 等. 烤烟烟叶淀粉颗粒结构特征与基本特性[J]. 中国烟草学报, 2013, 3(19): 49-53.He Fan,Wang Tao, Wang Mei, et al. Structural characteristics and properties of starch granules in fluecured tobacco leaves[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2013, 3(19):49-53. (in Chinese)

[8] 宫长荣，袁红涛，陈江华. 烘烤过程中环境湿度和烟叶水分与淀粉代谢动态[J]. 中国农业科学, 2003, 36(2):155-158.Gong Changrong, Yuan Hongtao, Chen Jianghua. Dynamic of Environmental Humidity and Moisture Content of Tobacco Leaves and Metabolism of Starch During Curing[J]. Scintia Agricultura Sinica, 2003, 36(2): 155-158.(in Chinese)

[9] 王涛, 贺帆, 詹军, 等. 烤烟淀粉微观结构特性及其与品质关系研究进展[J].中国烟草科学, 2013,34(1): 102-106.Wang Tao, He Fan, Zhan Jun, et al. Research Advance in Microstructure and Properties of Tobacco Starch and Their Relationship with the Quality[J]. Chinese Tobacco Science,2013, 34(1): 102-106. (in Chinese)

[10] 闫克玉，赵献章.烟叶分级[M].北京, 中国农业出版社，2003:18-24.Yan Keyu, Zhao Xianzhang. Tobacco Grading[M]. China Agriculture Press, 2003: 18-24. (in Chinese)

[11] 宫长荣.烟草调制学[M].北京, 中国农业出版社2003:154-161.Gong Changrong. Tobacco Curing[M]. China Agriculture Press, 2003: 154-161. (in Chinese)

[12] 王怀珠, 吕芬, 杨焕文. 烤烟淀粉代谢及对烟叶香吃味的影响[J]. 云南农业大学学报, 2004, 19(3): 290-294.Wang Huaizhu, Lv Fen, Yang Huanwen. Starch Metabolism of Flue-cured Tobacco and Effect on Aroma and Flavor of Tobacco Leaves[J]. Journal Of Yunnan Agriculture University, 2004, 19(3): 290-294. (in Chinese)

[13] 王晓宾, 孙福山, 王松, 等. 烤烟中淀粉的影响因素及其调控研究进展[J]. 中国烟草科学, 2008, 29(2): 53-57.Wang Xiaobin, Sun Fushan, Wang Song, et al. Advances in In fl uence Factors and Controlling Measures of Starch in Flue-cured Tobacco Leaves[J]. Chinese Tobacco Science,2008, 29(2): 53-57. (in Chinese)

[14] 高玉珍, 李伟, 王运锋, 等. 影响烤烟烟叶糖和淀粉含量的因素研究[J]. 中国农学通报, 2006, 22(6): 70-75.Gao Yuzhen, Li Wei, Wang Yunfen, et al. Study on Influential Factors of Sugar and Starch Content in Fluecured Tobacco Leaves[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2006, 22(6): 70-75. (in Chinese)

[15] 史宏志, 韩锦峰, 赵鹏, 等. 不同氮量与氮源下烤烟淀粉酶和转化酶活性动态变化[J]. 中国烟草科学: 1999(3): 5-8.Shi Hongzhi, Han Jinfeng, Zhao Peng, et al. Studies on the dynamic changes in amylase and invertase activity in fl uecured tobacco as a ff ected by nitrogen level and source[J].Chinese Tobacco Science, 1999 (3): 5-8. (in Chinese)

[16] 邱礼平, 温其标. 不同链淀粉含量玉米淀粉结构特性及其降解性能的研究[J]. 粮油加工与食品机械, 2005(10):83-86.Qiu Liping, Wen Qibiao. Research on the Structure Properties and Degradation Properties of Maize Starch with Different Amylose Content[J]. Machinery For Cereals Oil And Food Processing, 2005(10): 83-86. (in Chinese)

[17] 李佳佳, 卢未琴. 高群玉. 不同链淀粉含量玉米微晶淀粉理化性质研究[J]. 粮食与油脂, 2011(2): 13-17.Li Jiajia, Lu Weiqin, Gao Qunyu. Studies on physicochemical properties of microcrystalline starches made from different content of amylose[J]. Journal Of Cereals & Oils, 2011 (2): 13-17. (in Chinese)

[18] 何绪生, 张树清, 余雕. 生物炭对土壤肥料的作用及未来研究[J]. 中国农学通报, 2011, 27(15): 16-25.He Xusheng, Zhang Shuqing, Yu Diao. E ff ects of Biochar on Soil and Fertilizer and Future Research[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2011, 27(15): 16-25. (in Chinese)

[19] 刘志坤, 叶黎佳. 生物质炭化材料制备及性能测试[J].生物质化学工程, 2007, 41(5): 29-32.Liu Zhikun, Ye Lijia. Preparation and Performance Measurement of Biomass Charcoal Materials[J]. Biomass Chemical Engineering, 2007, 41(5): 29-32. (in Chinese)

[20] Glaser B, Lehmann J, Zech W. Ameliorating physical and chemical properties of highly weathered soils in the tropics with charcoal-a review[J]. Biology and Fertility of Soils,2002, 35(4): 219-230.

[21] 祖朝龙, 李桐. 烟草大棚直播漂浮育苗技术及应用[J].安徽农业技术师范学院学报, 2000, 14(4): 29-31.Zu Chaolong, Li Tong. The technology and application of tobacco seedlings infloating system in Greenhouse[J].Journal of Anhui Science and Technology University, 2000,14(4): 29-31. (in Chinese)

[22] 位辉琴, 申永防, 杜阅光, 等. 烟梗草炭在烟草漂浮育苗基质中的应用[J]. 烟草科技, 2013(9): 82-84.Wei Huiqin, Shen Yongfang, Du Yueguang, et al.Application of Tobacco Stem Peat in Matrix of Tobacco Floating Seedling System[J].Tobacco Science &Technology, 2013(9): 82-84. (in Chinese)

[23] 李现道, 张吉立, 姜鹏, 等. 不同草炭土用量对烤烟生长及产量质量的影响[J]. 山东农业科学, 2013, 45(9): 79-81, 86.Li Xiandao, Zhang Jili, Jiang Peng, et al. Effects of Different Amounts of Peat Soil on Growth, Yield and Quality of Flue-cured Tobacco[J]. Shandong Agricultural Sciences, 2013, 45(9): 79-81, 86. (in Chinese)

[24] 居静, 吴海波, 陈永林, 等. 日本产包膜控释氮肥对稻米品质的影响[J]. 江苏农业科学, 2015, 43(2): 67-70.Ju Jing, Wu Haibo, Chen Yonglin, et al. E ff ect of Japanese coated controlled-release nitrogen fertilizer on quality of rice[J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2015, 43 (2): 67-70.(in Chinese)

[25] 郑泽荣. 有机肥与化肥配施对小麦产量、品质形成及土壤养分变化的影响[D].山东农业大学, 2004.Zheng Zerong. Wheat grain yield and use quality and soil nutrients change in relation to the application of organic manure mixed with chemical fertilizer[D]. Shandong Agricultural University, 2004. (in Chinese)

[26] 朱法亮, 徐兴阳, 罗华元, 等. 植物透射电镜样晶制备技术探讨[J]. 中国野生植物资源, 2006, 25(3): 41-43.Zhu Faliang, Xu Xingyang, Luo Huayuan, et al. Plant Samples Preparation for the Transmission Electron Microscope[J]. Chinese Wild Plant Resources, 2006, 25(3):41-43. (in Chinese)

[27] 王洪波, 徐玉琼, 王颖, 等. 高氯酸超声萃取-连续流动法测定烟草中的淀粉[J]. 烟草科技, 2009(5): 44-47.Wang Hongbo, Xu Yuqiong,Wang Ying, et al. Determination of Starch in Tobacco by Ultrasonic Extraction and Continuous Flow Method[J]. Tobacco Science &Technology, 2009(5): 44-47. (in Chinese)

[28] 王文超, 贺帆, 宋朝鹏, 等. 双波长分光光度法测定烟草中的直链淀粉和支链淀粉[J]. 烟草科技, 2013(6): 50-53.Wang Wenchao,He Fan, Song Chaopeng, et al.Determination of Contents of Amylose and Amylopectin in Tobacco by Dual Wavelength Spectrophotometry[J].Tobacco Science & Technology, 2013(6): 50-53. (in Chinese)

[29] Gang Ren, Rosanne A. Healy, Harry T. Horner, et al.Expression of starch metabolic genes in the developing nectaries of ornamental tobacco plants[J]. Plant Science,2007(173): 621-637.

[30] Gregor W, Schmidt, Sven K, et al. Stable internal reference genes for normalization of real-time RT-PCR in tobacco(Nieotiana tabacum) during development and abiotic stress[J]. MoI Genet Genomics, 2010, 283(3): 233-241.

[31] 杨宇虹, 赵正雄, 李春俭, 等. 不同氮形态和氮水平对水田与旱地烤烟烟叶糖含量及相关酶活性的影响[J]. 植物营养与肥料学报, 2009, 15(6): 1386-1394.Yang Yuhong, Zhao Zhengxiong, LI Chunjian, et al. E ff ects of nitrogen fertilization on carbohydrate content and related metabolic enzymes of fl ue-cured tobacco in paddy fi eld and highland[J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2009,15(6): 1386-1394. (in Chinese)

[32] 李洪臣, 杨志晓, 武云杰, 等. 氮肥用量和施用方式对烟草中部叶碳氮代谢的影响[J]. 江苏农业科学, 2013,41(3): 65-68.Li Hongchen, Yang Zhixiao, Wu Yunjie, et al. Studies on the Carbon and nitrogen metabolism of the middle leaves of flue-cured tobacco as affected by nitrogen level and application mode[J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2013,41(3): 65-68. (in Chinese)

[33] 郭群召, 殷英. 草炭对烟田土壤理化性状及对烤烟生长发育、烟叶产质的影响[J]. 耕作与栽培, 2005(1): 38-39.Guo Qunzhao, Yin Ying. E ff ects of peat on Soil Properties and the growth, yield and quality of tobacco[J]. Culture With Planting, 2005(1): 38-39. (in Chinese)

[34] 万海涛, 刘国顺, 田晶晶, 等. 生物炭改土对植烟土壤理化性状动态变化的影响[J]. 山东农业科学, 2014, 46(4): 72-76.Wan Haitao, Liu Guoshun, Tian Jingjing, et al. Effect of Biochar for Soil Amendment on Dynamic Variation of Tobacco Soil Physical and Chemical Properties[J].Shandong Agricultural Sciences, 2014, 46(4): 72-76. (in Chinese)

[35] 王树会, 高家合. 不同草炭处理对植烟土壤理化性状及烟叶产质影响研究[J]. 中国农学通报, 2006, 22(12): 377-379.Wang Shuhui, Gao Jiahe. The Effect of Different Peat levels on Soil Physical and Chemical Traits and Tobacco Leaf Yield and Quality[J]. Chinese Agricultural Sciences Bulletin, 2006, 22(12): 377-379. (in Chinese)

[36] 刘新源, 刘国顺, 刘宏恩, 等. 生物炭施用量对烟叶生长、产量和品质的影响[J]. 河南农业科学, 2014, 43(2): 58-62.Liu Xinyuan, Liu Guoshun, Liu Hongen, et al. Effect of Biochar Application Amount on Growth, Yield and Quality of Tobacco[J]. Henan Agricultural Sciences, 2014, 43(2):58-62. (in Chinese)

[37] 段丽斌, 崔国民, 赵昶灵, 等. 烤烟烘烤中烟叶淀粉降解的研究进展[J]. 中国农学通报, 2013, 29(18): 180-186.Duan Libin, Cui Guomin, Zhao Changling, et al. Research Advances in the Degradation of the Leaf Starch of the Fluecured Tobacco During Flue-curing[J]. Chinese Agricultural Sciences Bulletin, 2013, 29(18): 180-186. (in Chinese)

[38] 黄强, 罗发兴, 杨连生. 淀粉颗粒结构的研究进展[J]. 高分子材料科学与工程, 2004, 20(18): 21-22.Huang Qiang, Luo Xingfa, Yang Liansheng. Progress of Research On the Starch Granules[J]. Polymer Materials Sciences & Engimeering, 2004, 20(18): 21-22. (in Chinese)

[39] 谭丽春. 植物淀粉生物合成酶的酶学特性分析[J]. 现代农业科技, 2008(23): 332-333.Tan Lichun. Enzymatic characteristics of plant starch biosynthetic enzymes[J]. Xiandai Nongye Keji, 2008(23):332-333. (in Chinese)

[40] 高振宇, 黄大年, 钱前. 植物支链淀粉生物合成研究进展[J]. 植物生理与分子生物学学报, 2004, 30(5): 489-495.Gao Zhenyu, Huang Danian, Qian qian. Advances in Research on Biosynthesis of Plant Amylopectin[J]. Journal of Plant Physiology and Molecular Biology, 2004, 30(5):489-495. (in Chinese)

[41] 张海艳, 董树亭, 高荣岐. 植物淀粉研究进展[J]. 中国粮油学报, 2006, 21(1): 41-46.Zhang Haiyan, Dong Shuting, Gao Rongqi. The Study Progress in Plant Starch[J]. Journal of the Chinese Cereals And Oils Association, 2006, 21(1): 41-46. (in Chinese)

Effect of compound organic fertilizer on starch biosynthesis in fl ue-cured tobacco leaves

YANG Shengnan, ZHANG Hongying, LIAN Wenli, NIU Dexin, CUI Hong
Key Laboratory of Tobacco Cultivation, College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China

E ff ect of compound organic fertilizer (biochar 30% and peat 70%) on starch biosynthesis in fl ue-cured tobacco was investigated through fi eld experiment. Characters such as ultrastructure of starch granule, starch accumulation in leaves were measured and the expression levels of starch biosynthesis-related genes were compared using tobacco variety Yunyan87. Results showed that applying compound organic fertilizer could markedly promote accumulation of starch granule in tobacco leaves. The number of starch granules increased and the volume became larger with the increase of application amount. Compound organic fertilizer could change starch components, i.e. total starch and amylopectin content increased, while amylose content decreased. Expression level of starch biosynthesis-related genes is in line with changes of starch content. The expression of granule bound starch synthase gene (GBSS1) weakened with increased application of compound organic fertilizer, while the expression of soluble starch synthase gene (SS1) enhanced. It was concluded that compound organic fertilizer can increase content of starch and change its composition.

fl ue-cured tobacco; compound organic fertilizer; starch; starch granule ultrastructure; biochar and peat

杨胜男，张洪映，连文力，等. 复合有机肥对烤烟淀粉生物合成的影响[J]. 中国烟草学报，2016,22（1）

中国烟草总公司特色优质烟叶开发重大专项（110200902045TS-01）

杨胜男（1991—），女，研究生，研究方向为烟草生物技术，Email:yangshengnan91@126.com

崔 红（1966—），教授，主要从事烟草生物技术研究，Email:cuihonger_13@163.com

2015-04-24

：YANG Shengnan, ZHANG Hongying, LIAN Wenli, et al. E ff ect of compound organic fertilizer on starch biosynthesis in fl ue-cured tobacco leaves[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016, 22（1）