卵巢癌患者外周血调节性T细胞与TGF-β、IL-10检测及其临床意义

于丹军,樊 静,门 帅,胡 月,姜 丽,曹丽艳,龚 珊

(1.秦皇岛市第一医院 检验科，河北 秦皇岛066000；2.秦皇岛市第四医院 检验科，河北 秦皇岛066000)



卵巢癌患者外周血调节性T细胞与TGF-β、IL-10检测及其临床意义

于丹军1,樊 静2,门 帅1,胡 月1,姜 丽1,曹丽艳1,龚 珊1

(1.秦皇岛市第一医院 检验科，河北 秦皇岛066000；2.秦皇岛市第四医院 检验科，河北 秦皇岛066000)

目的 探讨卵巢癌患者手术前后及化疗前后外周血CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)比例，与TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量变化的意义。方法 收集30例卵巢癌患者手术前后及化疗后的外周静脉血。采用流式细胞术检测外周血Treg比例；用ELISA法检测血清中细胞因子TGF-β1、TGF-β2、IL-10的含量，并以同期30例健康体检者为对照组。结果 与健康对照组比较，卵巢癌患者CD4+CD25+CD127LOW占CD4+T淋巴细胞的比率、CD4+CD25+Foxp3+占CD4+T淋巴细胞比率及TGF-β1、IL-10含量明显增高、TGF-β2明显降低，差异有统计学意义(P< 0.01)，手术后及化疗后外周血CD4+CD25+CD127LOW占CD4+T淋巴细胞的比率分别为[(1.610±0.465)%],[( 1.182±0.195)%],[( 1.033±0.210)%]；CD4+CD25+Foxp3+占CD4+T淋巴细胞比率分别为[(2.305±0.77)%],[(1.573±0.45)%],[(0.986±0.37)%]；细胞因子TGF-β1含量分别为(425.1±239.8) pg/ml,(287.5±239.8) pg/ml,(196.7±192.5) pg/ml；TGF-β2含量分别为(47.76±25.36) pg/ml，(32.22±17.81) pg/ml，(19.59 ±13.15) pg/ml；IL-10含量分别为(42.13±61.22) pg/ml,(17.34±11.21) pg/ml，(9.67±4.05) pg/ml，手术后及化疗后卵巢癌患者CD4+CD25+CD127LOW占CD4+T淋巴细胞的比率、CD4+CD25+Foxp3+占CD4+T淋巴细胞比率及TGF-β1、TGF-β2、IL-10的含量较术前明显减低(P<0.01)。结论 卵巢癌患者手术后及化疗后外周血CD4+CD25+CD127LOW占CD4+T淋巴细胞的比率、CD4+CD25+Foxp3+占CD4+T淋巴细胞比率及血清中细胞因子TGF-β1、TGF-β2、IL-10水平明显降低，动态监测它们的水平变化可作为评估卵巢癌患者免疫功能的可靠指标，对其辅助诊断及疗效观察的评价具有重要临床意义。

卵巢癌；调节性T细胞；Foxp3；细胞因子

(ChinJLabDiagn,2016,20:1655)

调节性T细胞(Treg)是一类具有免疫调节功能的抑制性淋巴细胞亚群，可以抑制免疫系统的抗肿瘤反应，从而促进肿瘤的发生、发展。同时它通过细胞接触抑制机制释放多种免疫抑制因子，如转化生长因子(TGF-β) 、IL-10等在诱导肿瘤的T细胞免疫耐受中发挥极其重要的作用[1,2]。转录因子叉头蛋白P3(Foxp3)在Treg的发育过程中起关键作用，Foxp3的表达是Treg细胞的一个特异性免疫标记[3]。本文通过检测卵巢癌患者手术前后及化疗后外周血中Treg细胞、Foxp3、TGF-β、IL-10的水平，为肿瘤的预防、诊断和治疗提供可靠依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2014年8月至2015年8月在秦皇岛第一医院经病理确诊的卵巢恶性肿瘤患者(浆液性乳头状囊腺癌，中低度分化-低度分化)30例，年龄(42-75)岁，中位年龄55岁。选择同时期来我院健康体检者30名(健康对照组)，年龄(33-77)岁，中位年龄53岁。

1.2 标本采集 卵巢癌患者在确诊24 h内未进行放化疗，采集静脉血2 ml(卵巢癌组术前)；术后1个月采血2 ml(卵巢癌组术后)；化疗4个周期后采血2 ml(卵巢癌组化疗后)，健康体检者采静脉血2 ml(健康对照组)，EDTA-K2抗凝。

1.3 试剂与仪器 流式细胞仪使用用美国贝克曼公司提供的XL四色分析仪，鼠抗人FITC-CD4、PE-CD25、PC5-CD127和同型对照鼠抗人IgG均购自美国贝克曼公司。Foxp3试剂盒购自美国ebioscience公司，IL-10、TGF-β1、TGF-β2试剂盒均购自Rapibio公司。

1.4 检测方法 用流式细胞仪测定CD4+CD25+CD127low占CD4+T淋巴细胞比率，CD4+CD25+Foxp3+占CD4+T淋巴细胞比率，用酶标仪检测各组血清中TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量，按照ELISA试剂盒说明书严格操作。

2 结果

2.1 与对照组比较，卵巢癌患者外周血CD4+CD25+CD127LOW占CD4+T淋巴细胞的比率、CD4+CD25+Foxp3+占CD4+T淋巴细胞比率明显增高、血清中TGF-β2含量明显降低、IL-10含量明显增高，差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 两组外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4+及CD4+CD25+Foxp3+/CD4+TGF-β1、TGF-β2、IL-10的水平

2.2 卵巢癌患者手术后及化疗后外周血CD4+CD25+CD127LOW占CD4+T淋巴细胞的比率、CD4+CD25+Foxp3+占CD4+T淋巴细胞比率、血清中TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 卵巢癌患者手术前后及化疗后外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4+、CD4+CD25+Foxp3+/CD4+TGF-β1、TGF-β2、IL-10的水平

注：Pa：手术前后P值；Pb:化疗后P值

3 讨论

近年来研究显示，卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌等恶性肿瘤患者的外周血和肿瘤局部微环境中Treg细胞比例明显增高，很多研究也已经证实在动物肿瘤模型与肿瘤患者外周血以及局部肿瘤组织中Treg细胞均显著升高[4-6]，因此大多数肿瘤患者抗肿瘤免疫功能低下与Treg细胞密切相关[7]。本研究中卵巢癌患者外周血CD4+CD25+CD127LOW占CD4+T淋巴细胞的比率、CD4+CD25+Foxp3+占CD4+T淋巴细胞比率与健康对照组相比明显增高，从而说明Treg细胞在肿瘤的发生、发展过程中起到抑制抗肿瘤免疫的作用。

Treg是具有显著免疫抑制作用的CD4 T细胞亚群，具有免疫无能和免疫抑制两大特性[8,9]，其对免疫系统功能具有抑制效应，维持机体免疫稳态，另外参与肿瘤的免疫调节功能，与肿瘤细胞的免疫逃逸与免疫耐受密切相关。Foxp3是Treg细胞生长发育和发挥细胞抑制功能的重要因子，可以促进肿瘤生长抑制及机体抗肿瘤免疫应答。本研究显示卵巢癌患者Foxp3显著升高，手术后CD4+CD25+CD127LOW占CD4+T淋巴细胞的比率、CD4+CD25+Foxp3+占CD4+T淋巴细胞比率均明显降低，提示其与肿瘤负荷相关。原因可能是肿瘤细胞通过某种机制诱导CD4+CD25+细胞增殖与分化，而调节性T细胞的增加又有利于肿瘤的进展。Treg可通过多种机制发挥其抑制免疫应答的功能，包括表达抑制细胞表面蛋白如细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)，分泌抑制因子如肿瘤坏死因子-β(TGF-β) 和白细胞介素-10(IL-10)，导致代谢紊乱和直接的细胞溶解等。本研究卵巢癌患者，IL-10、TGF-β的水平异常升高，手术后其水平随Treg水平减低而明显降低。TGF-β可以通过抑制宿主免疫活性细胞，进而促进肿瘤的发生、发展，IL-10具有双向免疫调节特性，它介导的免疫抑制机制是通过作用于不同的免疫细胞亚群，以多种方式发挥免疫抑制，造成机体抗肿瘤免疫逃逸。有研究证实Treg细胞在荷瘤鼠体内，能通过TGF-β和IL-10的作用调节免疫抑制[10-12]。同时研究结果显示，卵巢癌患者化疗后外周血CD4+CD25+CD127LOW占CD4+T淋巴细胞的比率、CD4+CD25+Foxp3+占CD4+T淋巴细胞比率、TGF-β以及IL-10水平均明显减低，可能与化疗抑制肿瘤的发生发展有关。本文通过检测Treg细胞、Foxp3、TGF-β以及IL-10水平，从而了解机体的免疫功能状态，尤其对肿瘤患者诊断、治疗及预后评估具有重要的理论和临床意义。

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Regulatory T cells in peripheral blood and IL-10、TGF-β detection and its clinical significance in patients with ovarian cancer

YUDan-jun,FANJing,MENShuang,etal.

(Clinicallaboratory,FirstHospitalofQinhuangdaoCity,Qinhuangdao066000,China)

Objective To explore the proportion of CD4+CD25+regulatory T cells in peripheral blood and the content variation of TGF-β1、TGF-β2、IL-10 in serum in patients with ovarian cancer before and after surgery and chemotherapy．Methods Collect 30 cases of patient’s peripheral venous blood with ovarian cancer before and after surgery and chemotherapy.Flow cytometry was used to detect the proportion of regulatory T cells; ELASA was used to detect content of TGF-β1、TGF-β2、IL-10 cytokines in serum,and 30 cases of healthy physical examination as the control group to the same period.Results Compared with healthy control group，the proportion of CD4+CD25+CD127LOWand CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells accounted for CD4+T lymphocytes and the content of TGF-β1、IL-10 in serum in patients with ovarian cancer was significantly higher ,TGF-β2 was significantly lower TGF-β2(P<0.01),the proportion of CD4+CD25+CD127LOWaccounted for CD4+T lymphocytes after surgery and chemotherapy was [(1.610±0.465)%],[( 1.182±0.195)%]and [( 1.033±0.210)%],respectively; The proportion of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells accounted for CD4+T lymphocytes after surgery and chemotherapy was [(2.305±0.77)%],[(1.573±0.45)%]and [(0.986±0.37)%],respectively; The content of TGF-β1 cytokines after surgery and chemotherapy was (425.1±239.8) pg/ml,(287.5±239.8) pg/ml and (196.7±192.5) pg/ml,respectively; The content of TGF-β2 cytokines after surgery and chemotherapy was (47.76±25.36) pg/ml，(32.22±17.81) pg/ml and (19.59 ±13.15) pg/ml ,respectively; The content of IL-10 cytokines after surgery and chemotherapy was (42.13±61.22) pg/ml,(17.34±11.21) pg/ml and (9.67±4.05) pg/ml,respectively.The proportion of CD4+CD25+CD127LOWand CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells accounted for CD4+T lymphocytes and the content of TGF-β1、TGF-β2、IL-10 in serum in patients with ovarian cancer was significantly lower after surgery and chemotherapy (P< 0.01).Conclusion The proportion of CD4+CD25+CD127LOWand CD4+CD25+Foxp3+accounted for CD4+T lymphocytes and the level of TGF-β1、TGF-β2 and IL-10 in serum in patients with ovarian cancer were significantly decrease after surgery and chemotherapy,monitoring their changes in levels dynamically can be used as the reliability index of evaluating the immune function of patients with ovarian cancer,and has important clinical significance on the auxiliary diagnosis and evaluation of curative observation.

Ovarian cancer;Regulatory T cells;Foxp3;Cytokines

1007-4287(2016)10-1655-03

R737.31

A

2015-12-25)