植物发酵液（酵素）对小鼠免疫功能的影响

刘春花，吴彬彬，3，陈宏运，何鑫平，潘永龙，颜晓庆，杨莉丽，梁岩

（1.中国科学院深圳先进技术研究院食品安全及环境技术研究室，广东深圳518055；2.北京大学深圳医院消化科，广东深圳518036；3.深圳市中科台富科技有限公司，广东深圳518100）

植物发酵液（酵素）对小鼠免疫功能的影响

刘春花1，吴彬彬1，3，陈宏运1，何鑫平1，潘永龙1，颜晓庆1，杨莉丽2，梁岩1

（1.中国科学院深圳先进技术研究院食品安全及环境技术研究室，广东深圳518055；2.北京大学深圳医院消化科，广东深圳518036；3.深圳市中科台富科技有限公司，广东深圳518100）

研究植物发酵液（酵素）对机体免疫功能的影响。将雄性BALB/c小鼠随机分为低、中、高剂量及对照组，分别经口给予1.25、2.5、5.0mL/kg·BW（相当于人推荐日服量的2.5、5、10倍）植物发酵液及生理盐水。连续灌胃4周后，对小鼠非特异性免疫功能和特异性免疫功能有关指标进行测定。植物发酵液（酵素）能明显提高小鼠胸腺指数，显著增强小鼠的碳廓清能力、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能，明显提高NK细胞杀伤活性，显著升高小鼠血清溶血素、溶菌酶水平，促进抗体生成细胞增殖，对小鼠的体重增长、脾脏指数、Con A诱导的小鼠脾细胞增殖分化能力、SRBC诱导的小鼠迟发型变态反应无明显影响。实验证明植物发酵液（酵素）对机体细胞免疫功能没有明显影响，但能显著提高机体非特异性免疫功能、体液免疫功能，具有增强免疫力功能的作用。

植物发酵液；非特异性免疫；体液免疫；细胞免疫

酵素是一类天然营养保健的发酵食品，深受日本消费者喜爱，近年开始在国内受到热捧。酵素，即植物发酵液，是指一些新鲜蔬菜、水果、糙米、菇类、药食同源中药等植物原料经榨汁或萃取工艺后再添加益生菌发酵［1］，产生的含有丰富多糖、低聚糖、有机酸、矿物质、酚类、萜类等营养成分及生物活性物质的混合液［1-3］。有关研究表明，植物发酵液类产品具有调节胃肠道、保护胃粘膜、抗肿瘤、抗氧化等功能活性［4-6］。有文献报道，植物发酵液可促进小鼠脾淋巴细胞增殖分化能力［7］，增强细胞免疫功能，提示植物发酵液可能具有调节免疫力功能，有待深入研究。因此，本研究从单核-巨噬细胞系统功能、NK细胞活性、细胞免疫功能、体液免疫功能等多方面考察植物发酵液对小鼠非特异性免疫和特异性免疫功能的影响，为酵素食品的保健功效和正确合理应用提供理论参考。

1　材料和方法

1.1样品

植物发酵液（酵素）样品：由深圳市中科台富科技有限公司提供。由29种果实类、44种蔬菜类、7种种子类、12种花蕈及海藻类、16种汉方草本类，共108种植物原料，经植物乳杆菌、嗜热链球菌等微生物发酵制备。其总可溶性固形物含量65.4％，总酸23.4g/L，总糖708g/L，总酚（以没食子酸计）620mg/L，总黄酮（以芦丁计）182mg/L。人体口服推荐剂量为30mL，成人体重按60 kg计算，折合剂量为0.5mL/kg。

1.2主要仪器与试剂

Scientific Multiskan GO全波长读数仪、371型二氧化碳培养箱：美国Thermo；CKX41倒置显微镜、BX53生物显微镜：日本奥林巴斯；UV6100紫外可见分光光度计：上海精密仪器；5180R台式高速冷冻离心机：美国Eppendorf。

绵羊红细胞（SRBC）：从北京润泽康生物科技有限公司购买新鲜脱纤维绵羊血制备；豚鼠血清：广州聚联生物技术有限公司；鸡红细胞：从深圳农贸市场购买健康公鸡通过静脉取血制备；印度墨汁：北京润泽康生物科技有限公司；YAC-1细胞：武汉普诺赛生命科技有限公司；RPMI1640培养液：美国Gibco公司；胎牛血清：浙江天杭生物科技有限公司；β-巯基乙醇：美国Amresco公司；氧化型辅酶Ⅰ（NADⅠ）：上海生物工程有限公司；刀豆蛋白A（Con A）、都氏试剂：美国Sigma公司；总蛋白（TB）、白蛋白（ALB）、总抗氧化能力（T-AOC）、溶菌酶（LZM）、一氧化氮（NO）测定试剂盒、快速瑞氏-姬姆萨复合染色液：南京建成生物工程研究所；其它为常规试剂。

1.3实验动物

雄性清洁级BALB/c小鼠，体重（18±2）g，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证为：SCXY（粤）2013-0002，在深圳市疾病预防控制中心实验动物屏障环境中饲养，实验动物使用许可证号为：SYXK（粤）2010-0068。

1.4动物分组与剂量选择

实验动物适应性喂养5 d后，按体重随机分为3个实验大组，免疫一组进行小鼠体重、免疫器官指数测定及小鼠碳廓清试验，二组测定腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验、NK细胞功能、Con A诱导脾细胞增殖分化试验，三组测定SRBC诱导迟发型变态（DTH）反应、抗体生成细胞测定、血清溶血素、血清溶菌酶等指标，每组8只～9只。每个试验大组均设对照组及低、中、高剂量组4个小组。

低、中、高剂量组小鼠分别经口灌胃给予植物发酵液（酵素）样品，剂量分别为1.25、2.50、5.00mL/kg·BW，相当于人推荐日摄入量0.50 mL/kg·BW的2.5、5、10倍，对照组灌胃生理盐水，每天灌胃1次，体积为10mL/kg·BW，连续灌胃4周以上。实验期间，小鼠自由摄食饲料和水，于末次给予受试物后对动物进行各项免疫指标测定。

1.5方法

1.5.1体重、免疫器官指数测定

称重后处死小鼠，取脾脏、胸腺，滤纸吸干血污后在电子分析天平上称重，计算脏/体比值。

免疫器官指数=胸腺（或脾脏）质量（mg）/体重（g）

1.5.2血清基本免疫指标测定

小鼠摘除眼球取血于离心管内，室温放置约1 h，使血清充分析出，5 000 r/min离心10min，收集血清，于-80℃保存。参照试剂盒说明书，测定血清TB、ALB、T-AOC、LZM、NO浓度。

1.5.3其他免疫指标的测定

根据《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）［8］免疫功能检测的程序，分别测定下列各项免疫指标：小鼠碳廓清实验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（半体内法）、NK细胞活性（LDH法）、Con A诱导的脾淋巴细胞增殖分化实验（MTT法）、SRBC诱导的小鼠迟发型变态反应（足跖增厚法）、抗体生成细胞测定（Jerne改良法）、血清溶血素测定（HC50法）。

1.6统计学方法

2　结果与分析

2.1植物发酵液对小鼠体重、免疫器官指数的影响

植物发酵液对小鼠体重、胸腺及脾脏指数的影响见图1。

图1　植物发酵液对小鼠体重、胸腺及脾脏指数的影响（±s，n=8～9）Fig.1 Effectof plant fermentation extractson thebody weight，thymusand spleen index inm ice（±s，n=8～9）

由图1可见，与对照组相比，低、中、高剂量组小鼠胸腺指数分别升高了18.18％、15.15％、18.94％，其中低、高剂量组差异显著（均P＜0.05），各剂量组小鼠体重、脾脏指数差异不显著（均P＞0.05），表明植物发酵液对小鼠胸腺的生长发育具有一定促进作用。

2.2植物发酵液对小鼠单核-巨噬细胞系统功能的影响

植物发酵液对小鼠单核-巨噬细胞系统吞噬功能的影响见图2。

由图2可见，与对照组相比，各剂量组小鼠碳廓清指数k、吞噬指数a均有所提高，其中低、中剂量组小鼠碳廓清指数k分别显著升高了54.52％、43.77％（均P＜0.01），吞噬指数a分别显著提高了14.52％（P＜0.05）、24.66％（P＜0.01），表明植物发酵液对小鼠碳廓清功能具有促进作用。与对照组相比，各剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率、吞噬指数b均有所提高，其中高剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率、吞噬指数b分别明显提高了54.87％、62.85％（均P＜0.05），表明植物发酵液对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能具有一定促进作用。

2.3植物发酵液对小鼠NK细胞功能的影响

植物发酵液对小鼠NK细胞杀伤活性的影响见图3。

由图3可见，与对照组相比，中、高剂量组小鼠NK细胞活性分别明显升高了52.87％、51.29％（均P＜0.01），低剂量组无明显变化，表明植物发酵液对小鼠NK细胞活性具有促进作用。

图3　植物发酵液对小鼠NK细胞杀伤活性的影响（±s，n=8）Fig.3 Effectof plant fermentation extractson the killing activity of NK cells inm ice（±s，n=8）

2.4植物发酵液对小鼠细胞免疫功能的影响

植物发酵液对小鼠细胞免疫功能的影响见图4。

图4　植物发酵液对小鼠细胞免疫功能的影响（±s，n=8）Fig.4 Effectof plant fermentation extractson the cellular imm unity inm ice（±s，n=8）

由图4可见，与对照组相比，各剂量组Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖分化能力、SRBC诱导的小鼠DTH反应中小鼠足跖肿胀度虽有所增加，但差异不显著（均P＞0.05），表明植物发酵液对小鼠细胞免疫功能没有明显影响。

2.5植物发酵液对小鼠体液免疫功能的影响

植物发酵液对小鼠体液免疫功能的影响见图5。

图5　植物发酵液对小鼠体液免疫功能的影响（±s，n=8）Fig.5 Effectof plant ferm entation extractson thehum oral imm unity inm ice（±s，n=8）

由图5可见，与对照组相比，低、高剂量组小鼠的溶血空斑数分别明显增加了21.98％、26.36％（均P＜0.01），中剂量组小鼠的溶血空斑数虽有所增加但差异不显著，该结果表明植物发酵液具有一定的促进小鼠抗体生成细胞增殖的作用。与对照组相比，低、中、高剂量组小鼠血清半数溶血值分别显著升高了2.71％、4.40％、2.89％（均P＜0.01），表明植物发酵液能够提高小鼠血清溶血素水平。以上数据表明植物发酵液对小鼠体液免疫功能具有明显的促进作用。

2.6植物发酵液对小鼠血清生化指标影响

植物发酵液对小鼠血清部分免疫指标的影响见表1。

表1　植物发酵液对小鼠血清部分免疫指标的影响（±s，n=8）Table1 Effectof p lant ferm entation extractson the serumimmune indexs inm ice（±s，n=8）

表1　植物发酵液对小鼠血清部分免疫指标的影响（±s，n=8）Table1 Effectof p lant ferm entation extractson the serumimmune indexs inm ice（±s，n=8）

注：与对照组相比，#表示差异显著；P＜0.05，##表示差异极显著，P＜0.01。

组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组TB/（g/L）47.83±1.24 48.46±2.04 48.04±2.72 47.45±2.78 ALB/（g/L）28.74±1.92 28.12±1.35 27.98±1.85 28.45±1.77 LZM/（μg/mL）1.66±1.01 4.31±1.95##4.27±1.14##3.50±1.69#NO/（μmol/L）41.05±9.90 46.38±8.24 41.08±10.05 57.6±20.65 T-AOC/（U/mL）5.75±0.97 5.19±1.19 6.28±0.87 7.67±2.44#

由表1可见，与对照组相比，低、中、高剂量组小鼠血清LZM水平分别明显升高了1.60、1.57、1.11倍（均P＜0.05），表明植物发酵液可明显提高血清LZM水平，增强机体抗菌能力。此外，与对照组相比，中、高剂量组小鼠血清T-AOC能力有所上升，高剂量组明显提高了33.39％（P＜0.05），表明植物发酵液可提高小鼠血清抗氧化能力，进而影响机体免疫力。另外，与对照组相比，各剂量组小鼠血清TB、ALB、NO水平差异不显著（均P＞0.05），表明植物发酵液对小鼠血清TB、ALB、NO水平没有明显影响。

3　讨论与结论

研究表明，植物发酵类食品具有调节免疫力功能［9-11］，如双歧杆菌混合发酵制备的发酵果蔬汁［10］、添加了人参提取物的益生菌发酵制备的混合果蔬发酵饮品［11］。生物有着非常强大的分解转化物质与产生丰富的次生代谢产物的能力，微生物发酵过程可以降解动植物原料中的有害物质和不易吸收物质，抑制病原菌生长，产生丰富多样的活性酶、营养物质和生物活性物质［9］。有研究发现敖东酵素能够显著增强正常小鼠脾淋巴细胞的增殖能力［7］。本研究对植物发酵液的调节免疫力功能进行了综合评价，发现植物发酵液可显著增强单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性、体液免疫功能，具有增强免疫力活性。

非特异性免疫，又称为先天性免疫，既是机体的第一道免疫防线，又是特异性免疫的基础［12］。胸腺和脾脏是重要的免疫器官，其体指数可以直观地反映机体免疫功能的强弱［9］。本实验中，植物发酵液各剂量组小鼠脾脏指数没有明显变化，但胸腺指数均有所提高，表明其可在一定程度上提高机体免疫能力。单核-巨噬细胞系统对异物具有很强的吞噬功能，是机体非特异性免疫功能的指标之一［10］。本实验中，低、中剂量植物发酵液显著提高了小鼠碳廓清指数k、吞噬指数a，高剂量植物发酵液明显提高了小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬指数b、吞噬百分率，表明其可增强单核-巨噬细胞系统功能。NK细胞是机体重要的免疫细胞，可直接非特异性杀伤靶细胞，是机体非特异性免疫的重要组成［12］。本实验中，中、高剂量植物发酵液能显著提升小鼠NK细胞活性，表明其可增强NK细胞功能。溶菌酶具有溶菌作用，在抵抗外界细菌入侵时起着重要作用［13］。本实验中，低、中、高剂量植物发酵液均可显著升高小鼠血清溶菌酶水平，表明其可增强机体抗菌防御能力。因此，植物发酵液（酵素）可通过增强机体单核-巨噬细胞功能、NK细胞功能等，提高机体非特异性免疫功能。

特异性免疫，又称为获得性免疫，具有抗原特异性，可分为细胞免疫、体液免疫［14］。细胞免疫主要是指T淋巴细胞借由释放淋巴因子发挥的免疫应答过程，体液免疫是指外来抗原诱导B淋巴细胞产生抗体来达到保护目的的免疫反应，两者相辅相成，共同发挥免疫作用。淋巴细胞的增殖反应和迟发型变态反应是检测机体细胞免疫功能的常用方法［11］。本实验中，与文献报道不同［7］，本实验中各剂量组小鼠的Con A诱导的脾细胞增殖分化能力、SRBC诱导的足跖肿胀度较对照组没有明显变化，表明其对机体细胞免疫功能没有明显影响。抗体生成细胞检测及血清溶血素的测定能够反映机体的体液免疫状态［15］。本实验中，低、高剂量植物发酵液显著提高正常小鼠的SRBC诱导的溶血空斑数，低、中、高剂量酵素均能显著提升血清溶血素水平，促进B淋巴细胞快速增殖分化和抗体生成能力，表明其能够增强机体体液免疫功能。因此，植物发酵液（酵素）可通过增强体液免疫功能，提高机体特异性免疫功能。

综上所述，植物发酵液（酵素）可以增强单核-巨噬细胞系统功能、NK细胞活性、体液免疫功能，提高血清溶菌酶水平，进而提高机体非特异性免疫功能和特异性免疫功能。根据《保健食品检验与评价技术规范》［8］中的判断标准，植物发酵液（酵素）具有增强免疫力功能。

［1］李晓青，刘俊江，陈宏运，等.植物发酵液的发展及其功效［J］.农产品加工（学刊），2014（1）：70-72

［2］Kuwaki Shinsuke，Nakajima Nobuyshi，Tanaka Hidehiko，et al. Plant-based Paste Fermented by Lactic Acid Bacteria and Yeast：Functional Analysis and Possibility of Application to Functional food［J］.Biochemistry Insights，2012，5：21-29

［3］Okada Hideki，Fukushi Eri，YamamoriAkira，etal.Structural analysisof three novel trisaccharides isolated from the fermented beverageofplantextracts［J］.Chemistry Central Journal，2009，3（1）：8

［4］赵金凤，曲佳乐，皮子凤，等.植物酵素润肠通便保健功能研究［J］.食品与发酵科技，2012，48（3）：54-56

［5］Okada Hideki，Kudoh Katsuhiro，Fukushi Eri，et al.Antioxidative Activityand ProtectiveEffectofFermented PlantExtracton Ethanolinduced Damage toRatGastric Mucosa［J］.Journalof Japanese Society ofNutrition and Food Science（Japan），2005，58：209-215

［6］LUMing，Toshima Yasushi，WU Xiaoling，etal.Inhibitory effectsof vegetable and fruit ferment liquid on tumorgrowth in Hepatoma-22 inoculationmodel［J］.Asia Pacific journalof clinicalnutrition，2007，16（S1）：443-446

［7］赵金凤，宿秀芹，曲佳乐，等.敖东酵素对脾淋巴细胞增殖作用的影响［J］.食品与发酵科技，2014，50（3）：50-52

［8］中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范［M］.北京：中国人民共和国卫生部，2003

［9］成黎.传统发酵食品营养保健功能与质量安全评价［J］.食品科学，2012，33（1）：280-284

［10］管晓冉，张德纯，李金玲，等.双歧杆菌发酵果蔬汁对小鼠免疫功能的影响［J］.中国微生态学杂志，2010，22（2）：110-113

［11］王智鼎，李岳飞，宋艳，等.一种复合果蔬发酵饮品增强免疫力功能研究［J］.食品研究与开发，2014（17）：115-118

［12］Turvey StuartE，Briude David H.Innate immunity［J］.Journalof Allergy and Clinical Immunology，2010，125（2）：S24-S32

［13］Jollès，Pierre，Jacqueline Jollès.What's new in lysozyme research？［J］.Molecularand cellularbiochemistry，1984，63（2）：165-189

［14］Bonilla Francisco A，Oettgen HansC.Adaptive immunity［J］.Journal ofAllergy and Clinical Immunology，2010，125（2）：S33-S40

［15］张永娟，吕学军，张大勇.缢蛏多肽对免疫抑制小鼠免疫功能的影响［J］.食品研究与开发，2010，31（11）：48-50

The Immunom odulatory Effect of the Plant Fermentation Extracts（PFE）in M ice

LIU Chun-hua1，WU Bin-bin1，3，CHEN Hong-yun1，HE Xin-ping1，PAN Yong-long1，YAN Xiao-qing1，YANG Li-li2，LIANG Yan1
（1.Lab for Food Safety and Environmental Technology，Shenzhen Institutes of Advanced Technology，Chinese Academy of Sciences，Shenzhen 518055，Guangdong，China；2.Digestive Department of the Shenzhen Hospital of Peking University，Shenzhen 518036，Guangdong，China；3.Shenzhen CAS-TFTechnology Co. Ltd.，Shenzhen 518100，Guangdong，China）

Effect of plant fermentation extracts（PFE）on immune functions in mice was investigated.Male BALB/c mice were randomly divided into four groups and orally administered a plant fermentation extracts（PFE）atdaily dosages of1.25，2.50，5.00mL/kg·BW（comparatively as 2.5，5，10 timesof recommended human daily dosage）respectively.Normalsalinewasused as the control.After4weeks，indexesofnon-specific and specific immunity function inmicewere examined.Compared with the control，plant fermentation extracts significantly increased the thymus index，improved the abilities of carbon particle clearance and peritoneal macrophage phagocytizing chicken red blood cells.The killing activity of NK cells，the levelof serum lysozyme and hemolysin，and the productive ability ofantibody forming cellswere also greatly increased.No obviousdifferences in the bodyweight，spleen index，con A-induced splenic lymphocyte proliferation and theability ofdelayed type hypersensitivity induced by SRBCwere observed in our study.These results indicated that the plant fermentation extracts（PFE）had noobvious impacton cellular immunity，butsignificantly strengthen thenonspecific immune function and humoral immunity inmice.Overall，plant fermentation extracts（PFE）possess enhancing immunity property.

plantfermentationextracts；non-specific immune function；humoralimmunity；cellularimmunity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.041

深圳市知识创新计划项目（JCYJ20140415162542973）；深圳市科技计划项目（CXZZ20150422152108120）；深圳市科技计划项目（CXZZ20150529144041624）

刘春花（1987—），女（汉），研究实习员，硕士，研究方向：食品科学、分子营养学、生物功能活性物质。

2015-10-26