黑豆皮提取物升高内源抗氧化酶延长果蝇寿命

孙振欧，王晓彬，王红，2，穆婉菊，张泽生，王浩，3，*

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；2.天津科技大学生物工程学院，天津300457；3.国家薯类深加工产业技术创新战略联盟，河北秦皇岛066000）

黑豆皮提取物升高内源抗氧化酶延长果蝇寿命

孙振欧1，王晓彬1，王红1，2，穆婉菊1，张泽生1，王浩1，3，*

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；2.天津科技大学生物工程学院，天津300457；3.国家薯类深加工产业技术创新战略联盟，河北秦皇岛066000）

黑豆因富含高含量的花青素而被作为天然食品抗氧化剂。本研究探讨黑豆皮提取物（Black Soybean Coat Extract，BSCE）对果蝇寿命的影响及其作用机制。拟以雄性黑腹果蝇为动物模型，饲喂添加0、0.5、1.5、4.5mg/mLBSCE的培养基，统计果蝇寿命，测定果蝇体内超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）活力，丙二醛（malondialdehyde，MDA）及蛋白质羰基的含量。Real Time-PCR法测定果蝇体内SOD、CAT、Nrf2及MTH的mRNA表达水平。结果显示饲喂BSCE可以显著延长果蝇的平均寿命（1.5、4.5mg/m L，P＜0.05）；饲喂4.5mg/m LBSCE可以显著升高果蝇体内Cu-Zn-SOD、Mn-SOD和CAT酶活力（P＜0.05）并极显著降低蛋白质羰基含量和MDA含量（P＜0.01）。Real Time-PCR结果显示，给予4.5mg/mLBSCE能够显著上调Mn-SOD、CATmRNA表达水平（P＜0.05）且极显著上调Cu-Zn-SOD、Nrf2mRNA表达水平（P＜0.01）。因此，黑豆皮提取物可以通过升高内源性抗氧化酶SOD和CAT活性延长果蝇寿命，且其调节机制与MTH基因有一定联系。

黑腹果蝇；黑豆皮提取物；酶活；抗氧化

1　引言

黑豆（Black Soybean）又名橹豆、乌豆，味甘性平，广泛种植于我国河北、山西、陕西等地，因其富含蛋白质、脂肪和氨基酸，同时含有多种微量元素、维生素及异黄酮、强心苷、谷胱甘肽、芦丁、大豆皂苷、花色苷等营养成分，自古即为我国传统的药食两用的特色粮油作物［1-2］。至2015年底，已有许多学者研究证实黑豆皮具有抗氧化、抗炎、免疫调节等多种生理活性［3-4］。Xu等基于DPPH和FRAP方法测量发现，黑豆总抗氧化能力90％集中于黑豆皮内［5］。赵艳威等发现黑豆皮可以提高糖尿病大鼠血清中超氧化物歧化酶、还原型谷胱甘肽活性，减少MDA生成，提高大鼠抗氧化能力［6］。杨乐民等发现黑豆皮提取物可以显著清除DPPH自由基和羟自由基，其清除率相当于维生素C的28.8％和47.0％；总抗氧化能力相当于维生素C的10.2％［7］。Takahashi等研究发现，与黄豆相比，黑豆皮可以使低密度脂蛋白氧化滞后时间显著延长［8］。

目前，基于动物模型探讨黑豆皮对寿命影响的研究尚且匮乏。Oregon K野生型黒腹果蝇（Drosophila melanogaster）因其代谢途径和衰老基因与人类十分相似，常被作为研究衰老因素的模式生物［9-10］。本实验研究黑豆皮提取物对雄性黑腹果蝇寿命、内源性抗氧化酶活力，丙二醛及蛋白质羰基的影响，并通过Real Time-PCR技术研究黑豆皮提取物对相关调控基因表达的调控，探讨其延缓衰老的作用机制。

2　材料与方法

2.1仪器与设备

HWS-850智能恒温恒湿培养箱：宁波海曙赛福实验仪器厂；UVmini-1240紫外/可见分光光度计：日本岛津公司；Real Time-PCR仪MyiQ2：美国BIO-RAD公司。

2.2材料与试剂

OregonK野生型黒腹果蝇（Drosophilamelanogaster）：天津科技大学食品添加剂与营养调控研究室。黑豆皮提取物（BSCE）：天津尖峰生物科技有限公司。Trizol试剂、cDNA合成试剂盒、SYBR Premix Ex Taq：宝生物生物工程有限公司（Takara）。SOD、CAT、MDA、蛋白质羰基试剂盒：南京建成生物工程研究所。无水葡萄糖、琼脂粉、对羟基苯甲酸乙酯均为分析纯；玉米粉为市售。

2.3方法

2.3.1饲养条件及实验分组

实验选用Oregon K野生型雄性黑腹果蝇，饲养条件、实验分组及果蝇基础培养基配方参考实验室前期文献方法［11］。给药组培养基：在基础培养基中分别添加0.5、1.5、4.5mg/mL黑豆皮提取物。

2.3.2果蝇寿命实验

果蝇饲养条件及分组同上。每4天更换培养基，剔除死亡果蝇并计数，至各组果蝇全部死亡。计算果蝇平均寿命和最高寿命（以最后存活的10％果蝇平均寿命计）。

2.3.3果蝇急性实验

2.3.3.1双氧水急性实验

果蝇饲养条件及分组同上。将25 d龄的果蝇饥饿处理2 h，后转移至新培养瓶中，瓶口放置含1mL 30％双氧水的6％葡萄糖溶液的饱和滤纸。每隔2小时统计果蝇存活量至全部死亡。

2.3.3.2百草枯急性实验

前期处理同上，瓶口放置含1mL 20mmol/L百草枯的6％葡萄糖溶液的饱和滤纸。每隔3小时统计果蝇存活量至全部死亡。

2.3.4果蝇内源性抗氧化酶活力、丙二醛及蛋白质羰基测定

果蝇饲养条件及分组同上。将45 d龄的果蝇饥饿处理2h，CO2麻醉后收集称重，冷冻保存于-80℃备用。冰上制备2％果蝇匀浆（生理盐水），2 500 r/min、4℃离心取上清，BCA法测定蛋白浓度，按试剂盒说明测定超氧化物歧化酶活力（黄嘌呤氧化酶法）、过氧化氢酶活力（紫外分光光度法）、丙二醛含量（硫代巴比妥酸法）以及蛋白质羰基含量（二硝基苯肼比色法）。

2.3.5Real Time-PCR法分析抗氧化基因mRNA表达

果蝇饲养条件及分组同上。收集45 d龄的果蝇，Trizol法提取果蝇总RNA，以RP49为内参基因，Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、CAT和MTH为目的基因，Real Time-PCR检测相关基因mRNA表达水平，95℃预变性10min，95℃变性5 s，58.5℃褪火30 s，55℃延伸10 s，30个循环。（特异性引物设计参考实验室前期文献［11］）。

2.4数据处理

所有数据均使用SPSS statistics17.0软件进行分析，通过t检验法进行统计学显著性检验，以P＜0.05为差异性显著，P＜0.01为差异性极显著。数据表示为平均值±标准差（X±S）。

3　结果与分析

3.1黑豆皮提取物对果蝇寿命的影响

相对于对照组，给药组果蝇平均体重无明显变化（P＞0.05）。饲喂不同浓度黑豆皮提取物的果蝇平均寿命和最高寿命相对于对照组均有延长，且呈剂量依赖关系，其中4.5mg/mL组果蝇的平均寿命及最高寿命为55.5 d和80.1 d，分别延长16.6％（P＜0.01）与21.7％（P＜0.05）。具体结果见图1和表1。

图1　果蝇寿命曲线Fig.1 Lifespan Curveof Drosophilamelanogaster

表1　黑豆皮提取物对果蝇寿命的影响Table1 Effectof BSCE on Lifespan of Drosophilamelanogaster

3.2果蝇急性实验

3.2.1双氧水急性实验

双氧水实验结果显示，不同剂量的BSCE延长果蝇寿命的作用明显且呈剂量依赖关系。其中饲喂4.5mg/mL黑豆皮的果蝇平均存活时间及最高存活时间为19.5 d和27.7 d，分别延长37.2％与22.9％（P＜0.05）。具体结果见图2和表2。

3.2.2百草枯急性实验

图2　双氧水急性实验Fig.2 Hydrogen Peroxide（H2O2）Challenge Test

表2　双氧水急性实验Table2 Hydrogen Peroxide（H2O2）Challenge Test

百草枯实验观察到与双氧水实验相似的结果。其中4.5mg/mL组果蝇的平均存活时间及最高存活时间分别为31.3 d和56.9 d，延长35.7％与42.9％（P＜0.05）。具体结果见图3和表3。

3.3黑豆皮提取物对果蝇内源性抗氧化酶活力、MDA和蛋白质羰基含量的影响

相对于对照组，给药组果蝇内源性抗氧化酶Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、CAT等活力均有增加，MDA和蛋白质羰基含量相对下降，且与黑豆皮提取物呈剂量依赖关系。其中4.5mg/mL组果蝇Cu-Zn-SOD、Mn-SOD和CAT酶活力显著增加（P＜0.05），MDA和蛋白质羰基含量极显著下降（P＜0.01）。具体结果见表4。

图3　百草枯急性实验Fig.3 Paraquat Challenge Test

表3　百草枯急性实验Table3 Paraquat Challenge Test

表4　黑豆皮提取物对果蝇体内Cu-Zn-SOD、CAT酶活性、MDA含量和蛋白质羰基含量的影响Table4 Effectof BSCE on Cu-Zn-SOD，CAT enzym eactivity，MDA contentand Protein Carbonylvalue in Drosophila melanogaster

3.4Real Time-PCR检测抗氧化基因Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、Nrf2及MTHmRNA表达水平

相比于对照组，给药组果蝇体内Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、Nrf2表达水平均有上调而MTHmRNA表达水平下调，且呈剂量依赖关系。其中4.5mg/mL组果蝇体内Mn-SOD、CATmRNA表达水平均显著上调（P＜0.05），Cu-Zn-SOD、Nrf2mRNA表达水平极显著上调（P＜0.01）。具体结果见表5。

表5　黑豆皮提取物对果蝇体内Cu-Zn-SOD、M n-SOD、CAT、Nrf2、MTH mRNA表达的影响Table5 Effectof BSCE on Cu-Zn-SOD，M n-SOD，CAT，MTH mRNA Expression in Drosophilamelanogaster

4　结果与讨论

Harman提出的自由基理论认为，组织细胞氧化性损伤的累积会引起衰老，随年龄增长，线粒体自由基生成增加，造成机体衰老［12］。减缓自由基的生成可以缓解随龄抗氧化能力的降低以及减轻随龄增加的氧化应激损伤，进而增加老龄动物的寿命。本实验结果表明果蝇给予4.5mg/mL黑豆皮提取物后，平均寿命和最高寿命分别延长了16.6％和21.7％（P＜0.05）。

张楠证实黑豆提取物能够延长小鼠游泳至力竭的时间，减少体内MDA生成，增加SOD酶活力水平，进而提高小鼠抗氧化能力［13］。本研究发现，饲喂黑豆皮提取物的果蝇内源性抗氧化酶Cu-Zn-SOD、Mn-SOD和CAT活力显著上升，MDA含量和蛋白质羰基含量显著下降。张瑞芬发现摄入黑豆皮提取物后，老龄小鼠血清超氧化物歧化酶活性和皮肤羟脯氨酸含量明显增加，而血清MDA生成量和脑组织B型单胺氧化酶活性则显著降低［14］；张继曼等研究发现黑豆皮花色苷可以降低糖尿病小鼠的血糖和血清中MDA含量，同时提高机体SOD、GSH-PX活性，具有清除氧自由基和抗脂质过氧化作用［15］，这与本研究呈现结果相一致。

摄入黑豆皮提取物可以显著上调抗氧化基因Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、Nrf2mRNA的表达水平，下调MTHmRNA表达水平。研究发现，Cu-Zn-SOD基因过表达可以显著延长果蝇平均寿命和最高寿命；Mn-SODmRNA过表达的转基因果蝇平均寿命和最高寿命分别延长30％～33％和37％；CAT基因过表达对延长寿命没有显著影响，但CAT和Cu-Zn-SOD双基因同时过表达，则可使果蝇的平均寿命延长34％［16］。

摄食百草枯进入体内能产生超氧化物阴离子自由基，进而损伤果蝇细胞［17］。摄食双氧水能生成羟自由基诱导果蝇产生急性氧化应激损伤［18］。研究发现，饲喂黑豆皮提取物的果蝇寿命显著延长，证明其自由基清除能力显著提高。董李平等研究发现黑豆皮提取物对超氧化物阴离子自由基和羟自由基有较明显的清除效果，清除率与浓度呈剂量依赖性［19］。

因此，饮食中添加黑豆皮提取物可以延长果蝇寿命，降低百草枯和双氧水引发的死亡率。其抗衰老机制很可能是通过上调内源性抗氧化基因的表达水平，进而增强内源性抗氧化酶活力，清除自由基，抑制脂质过氧化。

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Black Soybean Coat Extract Extends the Lifespan of Drosophilamelanogaster by Enhancing Endogenous Antioxidant Enzymes

SUNZhen-ou1，WANG Xiao-bin1，WANG Hong1，2，MUWan-ju1，ZHANG Ze-sheng1，WANG Hao1，3，*
（1.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science＆amp;Technology，Tianjin 300457，China；2.School of Biological Engineering，Tianjin University of Science＆amp;Technology，Tianjin 300457，China；3.The National Potato Processing Industry Technology Innovation Strategic Alliance，Qinhuangdao 066000，Hebei，China）

Black Soybean Coat Extract（BSCE）havebeen used asa natural food antioxidantwith high anthocyanins concentrations.The presentstudy investigate the effectof Black Soybean Coat Extract（BSCE）on the lifespan of Male Drosophila melanogaster and itsmechanism.Male Drosophila melanogaster were reared in medium containing 0，0.5，1.5，4.5mg/mLBSCE till they all died，then themean lifespan and themaximum lifespanwere determined.The activitiesofsuperoxide dismutase（SOD）and catalase（CAT），themalondialdehyde（MDA）contentand the protein carbonyl value contentwere analyzed.The expression ofantioxidantenzymes（SOD，CAT，Nrf2，MTH）mRNA were detected with Real Time-PCRmethod.Adding BSCE could prolong the lifespan of Drosophilamelanogaster（1.5，4.5mg/mL，P＜0.05）.Antioxidantenzyme activity assay resultsshowed thatadding 4.5mg/mLBSCE could significantly increase Cu-Zn-SOD，Mn-SOD ang CATenzyme activity（P＜0.05）and decrease the contentof protein carbonyl value and MDA level（P＜0.01）.According to the resultsofReal Time-PCR，BSCE of4.5mg/mL could remarkably increase Cu-Zn-SOD，Nrf2mRNA expression（P＜0.01）and CAT，Mn-SODmRNA expression（P＜0.05）.Itwasconcluded thatBSCE at leastpartially has lifespan-prolonging activity onmale Drosophilamelanogaster associated with its interactionswith MTH and endogenousantioxidantenzymes SOD and CAT.

Drosophilamelanogaster；Black SoybeanCoatExtract；enzymeactivity；antioxidantactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.003

国家薯类深加工产业技术创新战略联盟项目（2014GS001A）

孙振欧（1991—），男（汉），硕士研究生，研究方向：食品营养学。

王浩（1979—），男（汉），副教授，博士，研究方向：食品营养学。

2015-07-16