大鼠心房肌增龄性变化对心房颤动发生率及持续时间的影响

卫月娇，孟恬宇，孙超峰，蒋永荣，马舒婷

(西安交通大学第一附属医院心血管内科，陕西 西安　710061)



大鼠心房肌增龄性变化对心房颤动发生率及持续时间的影响

卫月娇，孟恬宇，孙超峰，蒋永荣，马舒婷

(西安交通大学第一附属医院心血管内科，陕西 西安710061)

目的：研究大鼠心房肌缝隙连接蛋白Cx40增龄性改变及增龄导致心房颤动发生率增高及房颤持续时间延长的原因。方法：随机取9～12月龄(青年组)、16～19月龄(中年组)、24～26月龄(老年组)健康雄性SD大鼠，每组24只。每组随机取12只通过尾静脉注射乙酰胆碱Ach-氯化钙混合液0.1 mL/100 g诱发房颤，监测其肢体导联心电图，记录各组大鼠房颤发生率及房颤持续时间。每组余下的12只大鼠麻醉后取心房组织，各组心房肌组织分别用苏木素一伊红及马森染色观察心房肌细胞及基质的改变，运用免疫荧光染色结合激光扫描共聚焦成像技术及免疫印迹技术检测Cx40的分布及量的改变。结果：老年组12只大鼠房颤发生率(83.3%，10只)及房颤持续时间均高于其他两组(P<0.05)，其心房肌细胞肥大，细胞排列稀疏，心肌纤维化明显。Cx40的表达量随增龄显著减少，老年组与青年组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，且缝隙连接蛋白的分布由端端排列为主渐趋杂乱。结论：老年组大鼠心房颤动诱发率较高及房颤持续时间长可能与心房组织形态结构增龄性重构、心房内缝隙连接蛋白Cx 40的数量减少及分布改变相关。

心房；缝隙连接蛋白40；心房颤动

随着老龄化社会的到来，心房颤动(房颤)已成为当今社会最常见的心律失常之一，其发病率高，发病原因复杂，给临床治疗带来了很大的难题[1]。老年人中，房颤更为常见，80岁以上的房颤患者约占总患病人数的三分之一[2]，并且其发病率呈现随年龄增长而日趋升高的趋势。60岁以下人群中，房颤的发病率仅为1%，而在75～84岁的人群中，房颤发病率增长至12%[3]。 已有多项研究[4-6]证实，年龄增加是房颤的独立危险因素。

缝隙连接(gap junction)是相邻细胞间进行物质与能量交换的主要通道，在心肌组织中，缝隙连接主要由缝隙连接蛋白(connexins，Cx)在细胞端端侧的闰盘处组成，是动作电位的形成以及心肌细胞协调收缩的基础[7-8]。目前，特异性表达于哺乳动物心肌组织中的缝隙连接蛋白主要是Cx40、Cx43和Cx45，其中，Cx40被证实与房颤的发生与维持最为相关[9]。

本实验通过药物干预不同年龄段大鼠，观察各组大鼠房颤发生率，并检测各组大鼠心房肌结构及Cx40的数量和分布，探讨心房肌组织的增龄性变化，为增龄性房颤的治疗提供一定的理论基础。

1　材料与方法

1.1实验动物及试剂

72只健康雄性SPF级SD大鼠，体重(250±20)g，购自西安交通大学医学部动物实验中心，实验动物生产许可证号：SCXK(陕)08-018，均符合西安交通大学医学部动物实验中心伦理管理委员会有关动物管理及使用规定。兔抗Cx40多克隆抗体(Abcam)，兔抗三磷酸甘油醛(GAPDH)单克隆抗体(Abcam)，硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG抗体及辣根过氧化物酶耦联羊抗兔IgG抗体均购自万类生物技术有限公司。

1.2房颤的诱导

实验大鼠饲养于西安交通大学医学部动物实验中心，自由饮水及饮食，自然12 h光照，适应性喂养1周后按照年龄分为3组：9～12月龄(青年组)、18～21月龄(中年组)、24～26月龄(老年组)，每组24只。10%水合氯醛麻醉后，根据相关文献[10]，其中12只大鼠房颤模型的建立通过尾静脉注射CaCl210 mg/mL+Ach 66 μg/mL 混合液，每天1次，持续7 d。每组其余12只大鼠常规饲养24 h，称重，10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，常规开胸，迅速摘取心房。

1.3心电图监测

每次尾静脉注射后各组大鼠均记录肢体导联心电图30 min。

房颤时间测定:以出现典型的房颤波f波及P波消失为房颤开始标志, 以f波消失P波出现，出现窦性心律为房颤终止标志。

1.4心房组织病理学观察

心房组织病理形态HE染色：取大鼠心房组织常规石蜡切片，经脱水，HE染色，二甲苯透明、中性树胶封片等步骤，普通光镜下观察。

心房组织胶原纤维Masson染色：取大鼠心房组织常规石蜡切片，脱蜡至水，重铬酸钾媒染剂浸泡组织约12 h，自来水和蒸馏水依次冲洗，Weigert苏木精染核10 min，流水充分冲洗，1%盐酸酒精分化，流水冲洗至返蓝，Masson丽春红酸性复红液染10 min，蒸馏水快速冲洗，1%磷钼酸水溶液分化5 min，苯胺蓝液复染3 min，0.2%冰醋酸浸洗，95%酒精、无水乙醇各脱水20 min，二甲苯透明，中性树胶封片，普通光镜下观察。

1.5Western-blot检测Cx40蛋白

将提取的心房组织用液氮快速处理，加入裂解液及蛋白酶抑制剂后冰上充分研磨匀浆，多次离心后提取组织蛋白，Bradford方法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液(loading buffer)后煮沸变性。使用10%的分离胶和4%的浓缩胶，每孔上样量20 μg，电泳结束后，将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，5%脱脂奶粉溶液(溶于Tris-HCl缓冲盐-Tween缓冲液，TBST)摇床上室温封闭1 h，分别将膜转入溶于TBST的兔抗Cx40单克隆一抗(1∶800)和兔抗GAPDH单克隆一抗(1∶1 000)中，4 ℃冰箱孵育过夜，TBST室温洗膜15 min×3次。室温下加羊抗兔二抗(1∶5 000)摇床孵育2 h，同前洗膜3次，TBS(Tris-HCl缓冲盐溶液)洗膜15 min×1次以洗掉Tween，ECL发光液浸泡5 min后凝胶成像系统摄像分析。

1.6免疫荧光染色及激光共聚焦扫描成像

大鼠新鲜心房组织4%多聚甲醛中固定24 h，30%蔗糖脱水48 h，使用OCT进行包埋，在-25 ℃恒冷切片机上切成6 μm厚的组织切片，将组织贴于多聚赖氨酸载玻片。玻片放入PBS缓冲液中漂洗5 min×3次，4%牛血清37 ℃温箱封闭30 min。将封闭液甩干后加入兔抗Cx40多克隆一抗(1∶100)， 4 ℃冰箱过夜。次日将切片用PBS缓冲液漂洗5 min×3次，加入FITC标记的羊抗兔IgG抗体(1∶400，避光)，37 ℃温箱孵育1 h，PBS缓冲液浸洗5 min×3次，含DAPI封片剂封片。使用激光共聚焦显微镜(Olympus)扫描488 nm波长的荧光，将图片处理后进行分析。

1.7统计学分析

2　结果

2.1心电图监测结果

与青年组(25%，3只)和中年组(41.7%，5只)相比，老年组共有10只大鼠成功诱发房颤，房颤发生率为83.3%，与其他两组相比显著升高且P<0.05。

青年组和中年组在给予干预后的中后期仅有部分大鼠诱发出房颤，而老年组在给予干预当天即有大鼠成功诱发出房颤，直至第七7天，房颤持续时间达到稳定，且与其他两组比较，持续时间明显升高，P<0.05(表1)。

表1　各组大鼠平均房颤持续时间的比较

*P<0.05，与青年组和中年组比较。

2.2心房组织病理学观察

根据图1可见，青年组及中年组大鼠心房组织细胞形态结构基本正常，细胞间排列紧密，无明显结缔组织增生，而老年组大鼠心肌细胞肥大，排列紊乱，细胞间结缔组织明显增生，符合心肌组织增龄退行性改变。

2.3各组大鼠心房肌Cx40的表达差异

根据图2的结果，青年组与老年组大鼠心房组织的Cx40量没有明显差别，而老年组大鼠Cx40的量与其他两组相比明显减少(P<0.05)。

2.4各组大鼠心房肌Cx40的分布改变

如图3所示，随着年龄的增长，Cx40的分布由典型的端端分布变为点团状的杂乱分布，这为房颤的发生及维持提供了病理结构基础。

3　讨论

根据我们的研究所示，老年大鼠房颤发生率高于其他两组且房颤持续时间较长，这可能与老年大鼠心房肌组织病理学改变以及Cx40的表达量及分布改变相关。目前，众多研究已证实房颤的发生和维持与心房重构密切有关。心房重构包括结构重构和电重构，早期以电重构为主，表现为离子通道及缝隙连接蛋白功能的改变，可以被逆转；而心房晚期重构则表现为结构重构，即心肌细胞肥大及排列紊乱、间质纤维化和心房扩张等，一旦发生很难被逆转[11-13]，并且会成为其他心脏疾病的结构基础。因此，抑制心房重构已成为临床上防止房颤复发、改善患者预后的重要目标。

老年人中房颤发生率较高，发达国家75岁以上的人群中，房颤的患病率高达 10%，甚至更高。因此，增龄性改变是房颤发生的重要危险因素。根据我们的研究结果，老年大鼠的心房肌组织出现细胞肥大，细胞排列疏松、紊乱，心肌间质纤维化明显且脂肪异常堆积等退行性改变，这些心肌组织的结构改变导致由肌纤维构成的心肌框架失去原本正常的传导功能，不仅如此，位于心肌细胞端端侧闰盘处的缝隙连接蛋白随着细胞结构的紊乱而发生错位，导致端端侧电流传导受阻而增加侧侧传导，易于形成心房内折返[11-13]，而折返是房颤发生与维持的经典机制。

缝隙连接作为心肌细胞间电与化学信号传递的重要通道，在维持电与机械偶联，确保心肌同步收缩方面起着重要作用[7-8]。增龄性衰退引起的缝隙连接蛋白的分布及表达量的变化都可以改变心房肌正常的激动传导方式，使心肌各向异性(横向与纵向传导速度之比)传导增加，心房肌正常激动传导方式发生改变，房颤易感性增加[14-15]。本实验发现，在老年大鼠中，心房组织Cx40的表达量明显下降，且分布由端端连接渐趋杂乱点团状分布，这种不规则分布促发多子波折返的出现，为房颤发生准备了病理基础。Zhang等[16]在动物模型中发现，房颤动物心房肌Cx40 表达量较对照组相比明显下降。由此可以看出，Cx40的改变可以诱发房颤，而房颤的发生又可以反过来加剧Cx40的改变，从而形成恶性循环，使阵发性房颤逐渐变为持续性房颤，增加了治疗难度。

总结起来，老年人房颤发生率远高于其他年龄人群与心房肌组织的增龄退行性改变有极大关系。目前已发现可以增强缝隙连接通道的电传导，改善心肌细胞间电偶联，有效改善传导速度的生物活性物质[17]，能否将此种物质运用于临床，有效地预防增龄性房颤，仍值得我们去深入研究。

[1]Tsang TS,Miyasaka Y,Barnes ME,etal.Epidemiological profile of atrial fibrillation:a contemporary perspective[J].Prog Cardiovasc Dis,2005,48(1):1-8.

[2]Wann LS,Curtis AB,Ellenbogen KA,etal.2011 ACCF/AHA/HRS focused update on the management of patients with atrial fibrillation (update on dabigatran):a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on practice guidelines[J].J Am Coll Cardiol,2011,57(11):1330-1337.

[3]Go AS,Hylek EM,Phillips KA,etal.Prevalence of diagnosed atrial fibrillation in adults:national implications for rhythm management and stroke prevention:the Anticoagulation and Risk Factors in Atrial Fibrillation (ATRIA) Study[J].JAMA,2001,285(18):2370-2375.

[4]Savino JA 3rd,Halperin JL.Age,Ethnicity,and Stroke Risk in Patients With Atrial Fibrillation:Another Stitch in the Patchwork[J].J Am Coll Cardiol,2015,66(12):1348-1349.

[5]Morrell MJ,McMillan A.Does Age Matter?The Relationship between Sleep-disordered Breathing and Incident Atrial Fibrillation in Older Men[J].Am J Respir Crit Care Med,2016,193(7):712-714.

[6]Nguyen TN,Pepperell D,Morel-Kopp MC,etal.Effect of Frailty and Age on Platelet Aggregation and Response to Aspirin in Older Patients with Atrial Fibrillation:A Pilot Study[J].Cardiol Ther,2016,5(1):51-62.

[7]Giovannone S,Remo BF,Fishman GI.Channeling diversity:gap junction expression in the heart[J].Heart Rhythm,2012,9(7):1159-1162.

[8]Liu F,Gutstein DE.The cardiac gap junction: a potential therapeutic target in the treatment of heart disease[J].Mt Sinai J Med,2002,69(6):421-424.

[9]Chaldoupi SM,Loh P,Hauer RN,etal.The role of connexin40 in atrial fibrillation[J].Cardiovasc Res,2009,84(1):15-23.

[10]陈春林,巩甜甜,汤依群,等.SD大鼠房颤模型的建立[J].实验动物科学,2009,(3):1-4.

[11]Lau CP,Tse HF,Siu CW,etal.Atrial electrical and structural remodeling: implications for racial differences in atrial fibrillation[J].J Cardiovasc Electrophysiol,2012,23 (Suppl 1):S36-40.

[12]Nishida K,Chiba K,Iwasaki YK,etal.Atrial fibrillation-associated remodeling does not promote atrial thrombus formation in canine models[J].Circ Arrhythm Electrophysiol,2012,5(6):1168-1175.

[13]Xu Y,Sharma D,Li GP,etal.Atrial remodeling: new pathophysiological mechanism of atrial fibrillation[J].Med Hypotheses,2013,80(1):53-56.

[14]Spach MS,Heidlage JF,Dolber PC,etal.Electrophysiological effects of remodeling cardiac gap junctions and cell size:experimental and model studies of normal cardiac growth[J].Circ Res,2000,86(3):302-311.

[15]Tribulova N,Knezl V,Okruhlicova L,etal.Myocardial gap junctions:targets for novel approaches in the prevention of life-threatening cardiac arrhythmias[J].Physiol Res,2008,57(Suppl 2):S1-S13.

[16]Zhang W,Ma X,Zhong M,etal.Role of the calpain system in pulmonary vein connexin remodeling in dogs with atrial fibrillation[J].Cardiology,2009,112(1):22-30.

[17]Rossman EI,Liu K,Morgan GA,etal.The gap junction modifier,GAP-134 [(2S,4R)-1-(2-aminoacetyl)-4-benzamido-pyrrolidine-2-carboxylic acid],improves conduction and reduces atrial fibrillation/flutter in the canine sterile pericarditis model[J].J Pharmacol Exp Ther,2009,329(3):1127-1133.

(学术编辑：刘涛)

本刊网址：http：//www.nsmc.edu.cn作者投稿系统：http：//noth.cbpt.cnki.net邮箱：xuebao@nsmc.edu.cn

Aging-related changes in rats and their effect on the high incidence rate and duration of atrial fibrillation in aged rats

WEI Yue-jiao，MENG Tian-yu，SUN Chao-feng，JIANG Yong-rong，MA Shu-ting

(DepartmentofCardiovasology,TheFirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity，Xi’an710061，Shaanxi，China)

Objective：To investigate the aging-related changes in gap junction protein-connexin 40(cx40)in rats and their effect on the high incidence rate and duration of atrial fibrillation in aged rats.Methods：The 72 healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3age groups(n=24，each),9-12 months(young-adult)，16-19 months(middle-adult) and 24-26 months(aged).Atrial fibrillation was induced by injecting mixed Ach-CaCl2solution into the caudal veins of SD rats which are selected randomly,12 rats in each group.The incidence rate and duration of atrial fibrillation was recorded by monitoring their limb-lead Electroa rdiogram(ECG)．The remaining 12 rats in each group take the atrial tissue after anesthesia,morphological changes of atrial myocardium were observed under optical microscope in Hematoxylin(HE) and Masson’s stain．The Cx40 protein expression was assessed by Western-Blot and the distribution of Cx40 was observed by confocal immunofluorescence microscopy.Results：The incidence rate(83%，n=10) and duration of atrial fibrillation was much higher and longer in aged group than in other two groups (allP<0.05)，and the aged group showed that atrial muscle cells were enlarged,the cells arranged sparse,and the myocardial fibrosis was obvious.The expression amount of Cx40 decreased as age increased compared with the young-adult,the difference was statistically significant(P<0.05),and the distribution of Cx40 changed from end-to-end to disordered arrangement.Conclusion：For aged rats,the high incidence rate and long duration of atrial fibrillation may be associated with atrial myocardium reconstruction,disarrangement of gap junction proteins and decreased expression amount of Cx40．

Atrium；Connexin 40；Atrial fibrillation

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.05.07

国家自然科学基金资助项目(81270236)

2016-05-19

卫月娇(1990-)，女，住院医师。E-mail：zgxlj@126.com

孙超峰，E-mail:csun1@163.com

时间：2016-10-2511∶31

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20161014.1716.014.html

1005-3697(2016)05-0648-04

R541.7；R363

A