油松针叶挥发油成分与含量动态变化分析*

段辉，樊世勇,汪文琦，刘镇林，蔡兴

(1.甘肃省分析测试中心，甘肃　兰州 730000；2.甘肃省科技厅培训中心，甘肃　兰州 730030)



油松针叶挥发油成分与含量动态变化分析*

段辉1，樊世勇1,汪文琦1，刘镇林1，蔡兴2

(1.甘肃省分析测试中心，甘肃兰州 730000；2.甘肃省科技厅培训中心，甘肃兰州 730030)

采用了GC/MS联用分析技术研究油松针叶挥发油含量及组分，考察不同季节、不同林龄、不同郁闭度等6因素对油松针叶组分及含量的影响，结果显示：松针挥发油主要成分为左旋乙酸龙脑酯、石竹烯及其氧化物、à-依兰油烯、匙叶桉油烯醇、荜茄醇、à-杜松醇、桑伯格醇等。树龄、季节、冠层、郁闭度、枝位等因素对挥发油含量有影响。本文综合分析挥发油化学成分及含量的动态变化，为松针工业开发应用提供科学依据。

油松；挥发油；GC/MS；季节；树龄；郁闭度；冠层

松属(PinusLinn.)植物为全球森林树种和用材树种，本属有90多种，为常绿乔木，其中，油松(PinustabulaeformisCarr.)耐寒、耐贫瘠能力高,优于本属其他树种，成为甘肃省的主要造林树种，其分布于陇南、陇东、天水等地，在每年的修林期及新陈代谢会产生大量废弃松针，是廉价的再生资源。松针开发国内外有报道，可形成松针精油、松针软膏、松针粉、抗癌扶正冲剂、松针饮料等产品[1～2]，松针是植物进行光合作用、合成有机营养物质的器官，产生包括免疫调节等生物活性的次生代谢物，其中挥发油含量约占2%左右。中国有56科136属植物含有挥发油，松科(Pinaceae Lindl.)柏科(Cupressaceae L.)位居首位，挥发油具有止咳、平喘、抗肿瘤等多方面的生物活性和功效药所含有的一类重要成分，尤其是挥发油中萜烯类化合物，在抑菌、抗真菌、抗肿瘤等方面发挥作用[3～7]。目前，松针挥发油的功效依赖于动物实验数据，有关松针挥发油成分及含量动态变化研究，尚没有相关报道。本文主要研究油松松针挥发油含量随树龄、季节等因素的动态变化规律，探讨不同季节针叶挥发油化学成分及含量变化差异，以期为油松松针的综合利用提供参考。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

FINNIGANTRACE DSQ GC/MS(气相色谱-四级杆质谱连用仪，美国热电公司)(Thero Electron Corportion)、挥发油提取器、无水乙醚(沸程30～60℃)、无水硫酸钠。

1.2样品采集与处理

选择陇南地区武都市柏林乡万亩油松人工林，以谷雨(2009年4月20日)、大暑(2009年7月25日)、霜降(2009年10月27日)、大寒(2010年1月25日)时节为采样时间；选择 4年、10年、25年树龄段；每一树龄分别选取郁闭度1、0.7和0.4，上、中、下3个冠层，东、南、北等3方位枝向，枝尖和枝中两枝位为采样点，按松林分布面积采用四分法随机抽取5个点采集松枝，剥离松针混匀，随机取样粉碎成0.5～1.0cm左右，备用。

1.3气相色谱-质谱分析条件

气相色谱条件TRACE GC Ultra(气相色谱仪)；DB-5ms色谱柱为30m×0.25mm×0.25μm；载气流速为1.2mL/min；进样口温度为220℃；程序升温为50℃恒温3min后，以20℃/min升温数率由50℃程序升温至120℃，再以5℃/min数率由120℃程序升温至250℃。

质谱条件TRACE DSQTM四级杆质谱仪；EI离子源，离子源温度为220℃；EI源能量为70eV，传输线温度为250℃；质量扫描范围为30～650amu；谱库为美国NIST-2002。

1.4松针挥发油提取

采用水蒸气蒸馏法[8]，多套挥发油提取装置同时提取。新鲜松针粉粹100g，装入圆底烧瓶中加500mL蒸馏水，接挥发油蒸馏萃取装置，1 000V可调电热帽加热烧瓶，沸腾后转小火蒸馏约12h，读取油状液体体积，用无水乙醚多次萃取，无水硫酸钠干燥过滤，除去溶剂，称重并低温保存,备用。

毛细管气相色谱分离挥发油成分，通过化学工作站数据处理系统，色谱峰面积归一化法[9～10]，测得各化学组分在挥发油中的百分含量，再经GC/MS测定，运用NIST-2002质谱数据库进行自动检索、解析，确认其化学成分，并在计算机检索的基础上进行人工识别和判读。

1.5数据处理

采用SPSS17.0统计分析软件及Excel 2007处理不同条件下的松针挥发油含量及平行测定进行数据并统计分析。

2　结果与分析

2.1季节对油松针叶挥发油含量的影响

分别选择1月、4月、7月、10月的大寒、谷雨、大暑、霜降时节为采样时间，代表冬、春、夏、秋4季。图1显示,夏、冬两季松针挥发油含量高于春、秋两季，且夏季挥发油含量相对稳定、较高，春季挥发油含量相对不稳定、较低，冬、秋两季介于前两者之间，究其原因,夏季油松新陈代谢活动旺盛，食叶害虫取食量大、病源菌繁殖快，林木需要较强的抵抗力来免受病虫侵害，其植株的松针挥发油较高而且比较稳定，与其抵御害虫和防御疾病的功能相适应，是抵御病虫害的反应；春季挥发油含量低而且不稳定，可能原因是害虫下树越冬、病源菌处于潜伏期，植株处于抽梢展叶期，树体内储备的养分主要用于新枝嫩叶的形态建成，较少用于主动合成挥发油以抵御病虫害，同样也说明了这一时期油松未发生病虫害的特点。

图1　不同季节油松针叶挥发油总含量变化Fig.1　The change of total content of volatile oil from the pine needle in different seasons

2.2不同生长状态下油松针叶挥发油含量的变化

在不同季节下，分别测定不同树龄、郁闭度、冠层、枝向油松针叶挥发油，采用SPSS17.0软件分析，结果见表1。

表1　不同因素及状态下松针挥发油含量Tab.1　The content of volatile oils in different factors and stages　mL/100g

注：不同字母表示油松在同一指标不同月份挥发油含量差异显著性，显著水平为0.05。

表1显示不同树龄、郁闭度、冠层、生长方向及枝位因素下挥发油的含量有差异。通过数量化理论及逐步回归分析和多重组间分析，结果显示：(1)树龄对挥发油含量有显著影响(p<0.05)，且随树龄增加呈先缓后快的增加趋势，树龄越大挥发油含量越高，其对病虫害抵御能力越强，油松幼树针叶受病虫害刺激时会主动提高挥发油含量以增强抗病能力。(2)冠层对油松针叶挥发油含量有显著影响(p<0.05)，高冠层相对于中冠层挥发油含量低且不稳定,可能受强光照射因素影响,中冠层挥发油含量高相对稳定，低冠层挥发油含量低与光照受限有关,高中冠层挥发油含量显著高于低冠层。(3)郁闭度对挥发油含量有显著影响(p<0.05)，随郁闭度增加挥发油含量呈降低趋势，郁闭度0.4时，针叶挥发油含量较高且比较稳定；郁闭度0.7时，针叶挥发油含量不太稳定，变化较大，郁闭度1.0时，挥发油含量低且稳定[12]。根据生态位构建理论，在可变资源环境中有机体通过自身的活动、选择及新陈代谢过程，可以部分地创建改造其生境。一般说来，郁闭度越大，林分内的小环境越稳定。作为抵御环境胁迫的代谢物质，针叶挥发油含量一般随着生境的稳定呈降低之势，这可能是挥发油含量随郁闭度增加而降低的原因所在。郁闭度0.4的样品全部采自树龄10年的林分，采样枝条或者是位于树冠顶部的冠层10，或者是位于树冠下部的冠层3，均处于树冠外围，要求针叶具备较高的抵御环境胁迫的能力，这可能是其针叶挥发油含量较高且比较稳定的原因所在。郁闭度0.7的样品采自树龄25年和4年的林分，采样枝条分别是冠层5、冠层3，均位于树冠下部，其针叶挥发油含量变化大实际反映的是树龄差异所带来的影响。(4)枝中含量高于枝尖，枝中针叶其叶龄高于枝尖针叶，前者抵御病虫害和环境胁迫的能力高于后者，而枝尖针叶处于生长旺盛期，这可能是枝中针叶挥发含量高于枝尖的原因，枝中和枝尖针叶挥发油含量不稳定，是季节、树龄、冠层和郁闭度等因子所带来的影响。(5)枝向对挥发油含量无显著影响。

2.3挥发油含量与各因素的相关性分析

采用逐步回归分析法，数据经过数量化处理，利用Excel软件计算获得挥发油含量逐步回归分析结果(表2)。

从表2可以看出，各回归方程的复相关系数最高为0.816 3，最低为0.534 3，相差达0.282 0，说明剔除枝位、枝向、树龄、冠层、郁闭度5个因子对回归方程的预测精度影响显著，也即挥发油含量与这5个因子紧密相关。在全部27个回归方程中，有一个明显的特点，凡是同时剔除冠层与树龄2个因子的回归方程，其复相关系数均明显低于同类回归方程，说明冠层与树龄在影响油松针叶挥发油含量方面具有很强的相关性。按回归方程复相关系数降低最小原则和各个因子的方差比最小的原则，逐步回归方程剔除的因子依次为枝向、枝位、冠层、郁闭度。表2反映了这一趋势，在全部6个因子中，对针叶挥发油含量影响依次为季节、林龄、郁闭度、冠层、枝位、枝向。为了深入分析各因子与挥发油含量测定值的相关程度，分别将剔除郁闭度或树龄因子的回归方程各类目的得分值作为其所属因子的替代性定量分析数据，利用SPSS软件进行相关分析(表3)。

表2　挥发油含量逐步回归结果Tab.2　The stepwise regression analysis for volatile oil content

注：**在0.01水平上显著相关;(1)由剔除林龄的回归方程计算得出，其他因子由剔除郁闭度的回归方程计算得出；(2)由剔除1个因子的回归方程中计算得出，为消除其他4个因子影响后某个因子与测定值的相关程度。

由表3可以看出，油松针叶挥发油含量与季节、冠层、树龄和郁闭度4个因子的单相关系数和偏相关系数均达到极显著水平，与枝位的偏相关系数也达到极显著水平。由此说明，油松针叶挥发油含量极显著地受季节、枝位、冠层、树龄和郁闭度5个因子的影响。其中，挥发油含量与郁闭度的单相关系数为负值，由于郁闭度的类目以数值大小为序，说明油松针叶挥发油含量随郁闭度增大而呈降低之势。综合变化趋势分析、逐步回归分析和测定值稳定性分析结果表明，影响油松针叶挥发油含量变化的因子其影响程度由高而低依次为季节、树龄、冠层、郁闭度和枝位，尤以季节的影响最为显著，其中，季节和枝位的影响各自独立，树龄、冠层和郁闭度的影响存在交互作用，尤以林龄和冠层之间的交互作用最大；枝向则无显著影响。

2.4不同季节挥发油的化学成分分析

将松针挥发油平均含量较高的冬季和夏季样本提取的挥发油分别合并，通过GC/MS分析分别鉴定出51个化合物，其中相似度在86%以上的化合物有22个，并为2个月份所共有的化合表物结构(图2及表3)。

图2　冬季、夏季油松松针挥发油总离子流图[11]Fig.2　Total ion chromatograms of volatile in oil pine needle in winter and summer

表4中显示两个代表季节的松针挥发油主要成分为蒎烯、莰烯、左旋乙酸龙脑酯、石竹烯、à-依兰油烯及匙叶桉油烯醇、石竹烯氧化物、依兰油醇、杜松醇、桑伯格醇等，两季节松针挥发油化学成分含量有差异，蒎烯和石竹烯是两个季节针叶挥发油的主成分。

2.5不同季节萜烯类化合物分析

季节不同挥发油萜烯化合物含量有差异(图3)。夏季萜烯类化合物总含量80.55%，冬季总含量为85.74%，萜烯类化合物总体水平高于雪松(Cedrusatlantica)松针[13]，不同季节含量差异与植物体自体新陈代谢调节及挥发油生物学活性有关。单萜化合物冬季36.20%、夏季41.52%，显示植物体在夏季以机体基础物质蓄积为主，并抵御昆虫侵害；倍半萜类化合物冬季36.34%、夏季30.63%，显示植物体在冬季化感作用强盛，以适应外界恶劣环境，保护自体生长。

倍半萜含氧衍生物冬季显著高于夏季，表明倍半萜及其含氧衍生物类化合物参与抵御外界环境影响作用，体现油松耐寒耐贫瘠能力。萜烯类化合物对昆虫具有诱导、驱避和传递信息等效应，还能杀菌和抑制周围邻近植物生长，油松针叶萜烯类化合物冬季高于夏季，再一次印证松针挥发油与植物体应对季节等环境因素变化而发挥生物学活性作用有关[12～15]。

表4　冬季、夏季油松松针挥发油化学成分分析[11]Tab.4　Chemical analysis of volatile oil in pine needle at different season

图3　两季节萜烯类化合物含量Fig.3　Terpenes content in winter and summer

3　结语

次生代谢物发挥着重要的生理及生物学活性作用。油松针叶挥发油在植物生长发育抵御外界环境干扰、抗病能力等方面发挥着重要生物学作用，其化学成分组成及含量随种属、生长期、季节、光照强度等因素变化。研究表明季节对挥发油含量有显著影响，且随树龄增大呈先缓后快的增加趋势，提示植物机体挥发油在成熟期主要发挥杀菌、抗脂质过氧化、抵抗环境影响作用，冠层、郁闭度、枝位对挥发油含量也有显著影响。挥发油成分分析显示单萜、倍半萜及其含氧衍生物是松针挥发油的主成分，其中蒎烯具有较强的解毒、抗炎、祛痰和抗菌作用，石竹烯对皮肤炎症及消化系统溃疡有较好的疗效[15-17]，单萜化合物夏季高于冬季，可用于医药及植物源农药原料，倍半萜类化合物冬季高于夏季，它是医药行业重要原料，倍半萜含氧衍生物冬季高于夏季，它是香气的主要成分，可用于药品和香料行业及食品添加剂[6]。实验表明挥发油含量随树龄增长呈增加趋势，夏、冬两季特别是夏季挥发油含量最高，春、秋两季挥发油含量较低。萜烯类化合物在夏、冬两季含量有差异，提示倍半萜及其含氧衍生物在冬季发挥生物学活性作用，尤其是化感作用。本研究还发现不同部位样品提取的挥发油在色泽、比重和浊度上有很大差异，可能是树龄和光照强度等因素导致化学成分差异所致，其影响因素及构效关系尚待进一步研究。

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Chemical Constituent and Content of Volatiles from Pine Needles of Pinus tabulaeformis Carr.

DUAN Hui1，FAN Shi-yong1，WANG Wen-qi1，LIU Zhen-lin1，CAI Xing2

(1.The Analysis & Research Center of Gansu Province，Lanzhou Gansu 730000，P.R.China；2.Training Center of Gansu Provincial Science and Technology Department，Lanzhou Gansu 730000，P.R.China)

Chemical constituents and contents of volatiles from pine needles ofPinustabulaeformisCarr.were studied by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS),and the impacts of 6 factors were also analyzed.The results showed that the main contents of volatiles from pine needles were L-bornyl acetate,Caryophyllene,Caryophyllene oxide,à-Muurolene,(-)-Spathulenol,tau.-Cadinol,à-Cadinol ect..Several factors such as different seasons,forest ages,tree canopies,crown densities,branch locations have significant impact on the content of pine needle volatiles.

PinustaulaeformisCarr；volatiles；GC-MS；season；forest age；crown density；tree canopy

10.166473/j.cnki.xblykx1972.2016.05.005

2015-10-14

甘肃省重大科技攻关项目“甘肃油松针叶有效成分分析及综合应用研究(2GS504-A41-006)”。

段辉(1965-)，女,研究员,博士,主要从事天然产物分析研究。E-mail：775341390@qq.com

简介：蔡兴(1959-),男,高级工程师，主要从事分析化学研究。E-mail:cxing407@163.com

S 791.254

A

1672-8246(2016)05-0024-07