应用液相阻断ELISA试验和正向间接血凝试验（IHA）检测猪O型口蹄疫抗体的比较分析

刘　阳，韦选民，张智鹏，李艳明，熊伟曼，张　靖，赵　力

（陕西省汉中市动物疾病预防控制中心，陕西 汉中 723000）

应用液相阻断ELISA试验和正向间接血凝试验（IHA）检测猪O型口蹄疫抗体的比较分析

刘阳，韦选民，张智鹏，李艳明，熊伟曼，张靖，赵力

（陕西省汉中市动物疾病预防控制中心，陕西 汉中 723000）

口蹄疫，是由口蹄疫病毒引起的急性、热性、高度接触性传染病，易感动物达70多种，主要侵害偶蹄类动物，少见于人。猪口蹄疫是国家要求强制免疫的重大动物疫病之一，对其免疫抗体检测的科学、准确性对有效防控口蹄疫尤为重要，但在实际检测过程中，常因检测方法不同而使检测结果有所差异，即使同一份血清用不同检测方法，其监测结果不一致的现象时有发生。

目前实验室检测猪O型口蹄疫抗体的方法，主要有液相阻断ELISA试验和正向间接血凝试验（IHA）。液相阻断ELISA试验农业部规定的抗体合格判定标准与试剂盒说明书一致，IHA试验农业部规定的抗体合格判定标准与试剂盒说明书存在差异，在实际检测过程中，无论IHA采用哪种结果判定标准，二者检测结果不一致的现象时有发生。为此本试验选择这两种方法分别对284份猪血清样品进行O型口蹄疫免疫抗体平行对比检测，针对不同的（IHA）结果判定标准详细比较二者检测结果的一致性，从而找出影响两种检测方法结果一致的因素，对两种方法提出较为客观、公正的评价，为实验室口蹄疫抗体检测方法的选择提供参考依据。

1　材料与方法

1.1样品血清样品来自口蹄疫疫苗比对试验所采猪血清，共检测猪血清284份。

1.2试剂口蹄疫O型正向间接血凝抗体检测试剂盒，批号2014081804。口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒，批号：2014063001，抗原批号：2014062501，抗原使用浓度1∶11。以上均购自中国农业科学院兰州兽医研究所。

1.3仪器设备单道、8道微量移液器，均购自德国Brand公司；酶标仪型号为MULTISKAN FC，赛默飞世尔（上海）仪器有限公司生产；电热恒温培养箱型号为DHP-9162，上海一恒科学仪器有限公司生产；超纯水仪型号为UPH-11-20T，成都超纯科技有限公司生产。

1.4检测方法与结果判定标准正向间接血凝试验按试剂盒说明书进行操作。按农业部［农医发（2012）2号］文件要求，判定标准：其有效抗体≥1∶32（第5孔）呈现“++”凝集为免疫合格；按中国农业科学院兰州兽医研究所试剂说明书要求，判定标准：其有效抗体效价≥1∶128（第7孔），呈现“++”凝集为免疫合格。

液相阻断ELISA试验按试剂盒使用说明书进行操作，波长492 nm，病毒抗原对照D492 nm在1.5±0.5范围内，阳性对照抗体效价在1∶1024±1滴度以内，阴性对照血清抗体效价＜1∶8，试验算成立。样品结果判定方法依据试剂盒说明书结果判定方法进行判定，判定标准：猪血清抗体效价≥1∶64为免疫合格（与农业部规定标准一致）。

2　结果与分析

2.1ELISA和IHA不同判定标准样品合格率的比较由表1可见，总样本液相阻断ELISA试验的合格率为44.72%（127/284）；正向间接血凝试验（IHA）按农业部标准（抗体滴度≥25）的合格率为66.20%（188/284），按试剂说明书要求（抗体滴度≥27）的合格率为20.77%（59/284），按本试验设计标准（抗体滴度≥26）的合格率为41.20%（117/284）。由此可见，农业部要求的正向间接血凝（IHA）的检测合格率明显高于液相阻断ELISA的检测合格率，误差率高达21.48%（61/284），经X2检验差异极显著（P＜0.01），其结果与周家喜等［1］、陈桂英［2］的试验结果一致；按试剂盒说明书要求的正向间接血凝试验结果判定标准，其检测合格率明显低于液

相阻断ELISA的检测合格率，误差率23.59%（68/ 284），经X2检验差异极显著（P＜0.01）。而按本试验设计的正向间接血凝试验判定标准，其检测合格率与液相阻断ELISA试验基本一致，误差率仅为3.52%（10/284），经X2检验差异不显著（P＞0.05）。说明以本试验设计标准为IHA判定标注，其检测合格率与液相阻断ELISA试验基本一致，过高或过低的IHA判定标准都会影响其与ELISA合格率的一致性。

2.2ELISA与IHA重复性比较由表2可见，在284份样品中，ELISA方法检测合格127份，同时IHA方法检测合格108份（抗体滴度≥25）或45份（抗体滴度≥27），ELISA方法检测不合格157份，同时IHA方法检测不合格81份（抗体滴度＜25）或147份（抗体滴度＜27）；总样本中两种检测方法相一致的符合率为66.55%（189/284）、67.61%（192/284）。说明IHA方法与ELISA方法检测数的符合率差异，与IHA采用不同的抗体合格判定标准无关。

表1　284份样品ELISA和IHA检测结果比较　单位：份、%

表2　ELISA与IHA不同判定标准结果符合率比较

2.3IHA抗体滴度与ELISA相关性的分析由表3可见，在以抗体滴度≥25为判定标准的IHA检测合格188份中，同时ELISA检测不合格78份，误差率41.49%（78/188）；在以抗体滴度≥27为判定标准的IHA检测合格59份，同时ELISA检测不合格10份，误差率16.95%（10/59），其中有2份抗体滴度在7孔以上，ELISA检测却不合格。说明IHA检测判定标准越高，与ELISA合格数的误差率越低，同时也说明ELISA检测方法同样也会出现一定误差。

2.4IHA抗体滴度大小与ELISA抗体滴度相关性比较由表4可得，用IHA检测抗体滴度≥25，同时ELISA检测抗体滴度≥1∶22的样品共56份，其中有37份ELISA检测抗体滴度在1∶45-1∶90之间，占总样品的66.07%（37/56）；用IHA检测抗体滴度≥26，同时ELISA检测抗体滴度≥1∶22的样品共54份，其中有32份ELISA检测抗体滴度≥1∶90，占总样品的59.26%（32/54）；用IHA检测抗体滴度≥27，同时ELISA检测抗体滴度≥1∶22的样品共32份，其中有26份ELISA检测抗体滴度≥1∶90，占总样品的81.25%（26/ 32）；用IHA检测抗体滴度≥28，同时ELISA检测抗体滴度≥1∶22的样品共11份，其中有10份ELISA检测抗体滴度≥1∶90，占总样品的90.91%（10/11）；用IHA检测抗体滴度≥29，同时ELISA检测抗体滴度≥1∶22的样品共12份，其中有12份ELISA检测抗体滴度≥1∶90，占总样品的100%（12/12）。说明用IHA检测样品抗体滴度越高，用ELISA检测抗体滴度也越高。

表3　IHA抗体滴度大小ELISA合格数的误差关系

由表5可见，ELISA检测出的相同抗体滴度的样品，再用IHA检测抗体滴度分布范围较广，但绝大多数分布在相近的抗体滴度范围内，同时ELISA检测抗体滴度越高，IHA检测抗体滴度也越高。

表4　IHA检测不同抗体滴度对应ELISA检测结果分布统计

表5　ELISA抗体滴度大小与IHA抗体滴度相关性比较

3　讨论

3.1按农业部标准，其有效抗体≥25（第5孔）为免疫合格时，IHA的检测合格率明显高于ELISA的检测合格率。若以IHA试剂盒说明书标准，其有效抗体≥27（第7孔）为免疫合格时，IHA的检测合格率又明显低于ELISA的检测合格率。而以本试验设计标准为准，其有效抗体≥26（第6孔）为免疫合格时，IHA的检测合格率与ELISA检测合格率基本一致，这说明IHA的判定标准对样品合格率的影响较大，选用合适的IHA判定标准，可以提高这两种试验检测结果的一致性。

3.2在ELISA和IHA的相关性比较中，IHA判定标准越高，其检测结果与ELISA检测结果的符合率越高。分析原因，主要是IHA敏感性较高，特异性却很低，容易产生假阳性，且试验结果主要通过肉眼观察，主观性强；ELISA敏感性较低，特异性却很高，样品抗体水平较高时，ELISA更容易检测出阳性，且试验结果全部通过仪器测量，人为因素干扰小，结果准确性更高。试验中用IHA检测抗体滴度等于5的样品共71份，对这71份样品再用ELISA检测却只有29份合格；IHA检测抗体滴度≥9的样品共13份，用ELISA检测时有12份合格，也说明了IHA敏感性高，特异性低，会产生假阳性，ELISA敏感性较低，特异性较高。

3.3IHA检测出的不同抗体滴度的样品，再用ELISA检测，抗体滴度分布较广，但绝大多数分布在相近的抗体滴度范围内（从表4和表5中可以看出）。分析原因主要是IHA检测人为因素干扰较大，主观性较强，存在非特异性凝集，导致IHA检测抗体滴度很高，ELISA检测抗体滴度却很低。

3.4目前IHA试验，仍是我国运用最为广泛的口蹄疫免疫抗体监测方法，这也是行业标准中推荐的方法之一，而液相阻断ELISA方法作为一种生物学方法，也常常被用来检测其抗体，同时也是国家推荐使用的方法。IHA的原理是利用提纯的口蹄疫病毒致敏于醛化绵羊红细胞上，制成口蹄疫血凝抗原，用于检测血清中的抗体水平。该方法简单易行，适合于基层单位应用，但特异性低，有假阳性现象。在国际上该方法已不再使用。液相阻断ELISA试验原理是抗原抗体在液相中反应，与病毒中和试验原理相似，又被称为体外病毒中和试验，是国际兽医局（OIE）推荐的监测口蹄疫病毒抗体的标准方法。

4　结论

（1）IHA试验使用仪器设备少，操作简便快速，试剂盒价格低廉；而ELISA试验，要求技术人员操作熟练，使用仪器设备多，操作步骤繁琐，耗时较长，且试剂价格昂贵。在基层运用较多的还是IHA试验，而且IHA也是国家允许使用的口蹄疫抗体检测方法，因此在基层，实验条件不好的地方，如能科学地应用，IHA方法仍不失为基层较好的检测方法；在小范围抽样下，实验条件较好的地方，应使用OIE标准和农业部标准中均采用的液相阻断ELISA方法［3］。

（2）从诊断试剂稳定性来看，ELISA试剂性能稳定，重复性好，而IHA试剂性能稳定性不够好，重复性差。因此，基层采用IHA来评估口蹄疫免疫抗体水平，需要提高检测技术和判定标准，以减少误判。

（3）在每年的重大动物疫病防控效果考评中，政府都要投入大量的人力、物力、财力进行抽样检测，评估免疫效果，但检测结果常因检测方法或检测试剂不同而不尽一致，给免疫效果评估工作带来了不便，同时也干扰了口蹄疫的防控工作。因此，选择一种可靠的、通用的口蹄疫免疫抗体检测方法来指导基层动物防疫工作，科学准确评价动物群体免疫状况和抗感染能力，才能最终达到有效控制口蹄疫的效果。

［1］周家喜，邓铨涛，余波，等.猪口蹄疫免疫抗体不同检测方法的对比试验［J］.中国畜禽种业，2009（7）：149-150.

［2］陈桂英.不同方法检测O型口蹄疫免疫抗体的对比试验［J］.黑龙江畜牧兽医，2011（16）：101-102.

［3］GB/T 18935-2003，口蹄疫诊断技术［S］.北京：中国标准出版社，2003-05-01.

S852.52

B

0529-6005（2016）04-0061-03

2015-01-16

刘阳（1987-），男，助理兽医师，本科，主要从事动物疫病防控工作，E-mail：814222659@qq.com

韦选民，E-mail：fffsys2255543@126.com