维生素D缺乏影响受孕及胚胎发育的小鼠动物模型研究

王波 王雪云

·论著·

维生素D缺乏影响受孕及胚胎发育的小鼠动物模型研究

王波 王雪云★

目的通过建立小鼠模型考察维生素D缺乏对受孕力水平及胚胎发育的影响。方法采用数字随机法则将雌鼠分为维生素D缺乏组（vitamin D deficiency，VDD组）与对照组（Control组），VDD组采用维生素D低含量饲料喂养，Control组采用标准饲料喂养，喂养2周后合笼。结果GD13时，VDD组孕鼠的胚胎着床数（9.52±1.75）显著低于Control组的（13.34±2.16）（P＜0.01）；VDD组孕鼠的胎儿流产率明显上升；VDD组孕鼠的胎盘重量为（0.058 7±0.017 6）g，显著低于Control组的（0.078 6±0.014 3）g（P＜0.01）；VDD组孕鼠的胎盘海绵体滋养层细胞面积为（86.20±6.06）％，显著小于Control组的（100.00±4.51）％（P＜0.01）；GD21时，VDD组孕鼠的血清25（OH）D浓度为（6.32±0.51）nmol/ m L，Control组孕鼠的血清25（OH）D浓度为（13.46±0.62）nmol/m L，组间比较Control组显著更高（P＜0.01），与Control组比较，VDD组的活胎数、孕鼠孕期增重、胎鼠体重、胎盘重量及胎鼠身长显著降低（P＜0.01），吸收胎数与死胎数显著增加（P＜0.05或P＜0.01）。结论母体维生素D缺乏是导致小鼠受孕力水平降低及妊娠后胚胎发育迟缓的重要影响因素之一，在孕前及孕期科学补充维生素D对提高育龄期小鼠受孕力水平及保障妊娠后胚胎良性发育具有重要意义。

维生素D；受孕力；胚胎发育；动物模型

受孕率水平与胎儿的宫内生长发育是与生殖健康直接相关的2个非常重要的方面。而当前的一系列研究表明，受多因素影响，人类自然受孕力在近几十年内或将呈现出下降趋势［1］。同时也有报道显示，宫内生长发育迟缓（intrauterine grow th retardation，IUGR）的全球发生率为11％，我国大概为6.4％，虽然低于全球整体水平，但由于我国出生人口的基数相对更大，故每年出生的IUGR患儿例数保守估计应不低于100万［2］。IUGR不仅存在导致胎儿宫内死亡的风险，而且即使顺利出生，在此之后的患病与死亡几率也显著高于正常新生儿。因此，科学防控受孕力水平下降与IUGR 2种情况的发生对提高全社会生殖健康水平与人口素质具重要现实意义。

维生素D缺乏与人类健康的关系一直受到临床的普遍关注。早期的研究证实维生素D缺乏是佝偻病与软骨病等疾病的重要诱因之一［3］。人体所需的维生素D主要来源于皮肤经光照作用由7-脱氢胆固醇转化并贮存在体内的25（OH）D。故随着很大部分人群其工作模式由过去的户外作业向室内转移，维生素D缺乏也势必更为普遍。最近的一项流行病学调查资料显示，孕期妇女维生素D水平低下［血清25（OH）D浓度≤30 ng/m L］者约占76.1％，其中严重缺乏［血清25（OH）D浓度≤20 ng/m L］者甚至高达44.6％。另一项小样本对照研究发现，胚胎停育以及小于胎龄儿其母体孕期维生素D缺乏的发生率较对照组显著更高［4］。然而，维生素D缺乏是否与女性的受孕力水平及发生IUGR具有直接关联目前尚未探明。鉴于此，本研究特建立维生素D缺乏的小鼠动物模型，旨在揭示维生素D缺乏对受孕力水平及胚胎发育的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级ICR小鼠60只，每组各30只，小鼠及喂养饲料均购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。小鼠均为8周龄，雄鼠体重31～35 g，雌鼠体重28～30 g。饲料包括标准饲料（维生素D3含量＞800 IU/kg）与维生素D低含量饲料（维生素D3含量25 IU/kg）2种。

1.2 方法

采用数字随机法则将雌鼠分为维生素D缺乏组（VDD组）与对照组（Control组），2组小鼠的毛色、活动度以及本实验之前的饮食状况等基线资料组间比较无统计学意义（P＞0.05）。VDD组采用维生素D低含量饲料喂养，Control组采用标准饲料喂养，2组小鼠均自由饮食。喂养过程中控制环境温度20～25℃，环境相对湿度（50±5）％，接受一致光照，但对VDD组实施紫外波段过滤。照上述方法喂养2周后于9：00 PM进行雌雄合笼，雌雄比例为4：2，次日7：00 AM检查雌鼠阴栓，若在阴道至子宫颈的腔内有发现白色浆液性物质则视为交配成功，同时将本日定为妊娠0 d（GD0）。

1.3 观察指标

①于GD13各组随机抽取10只孕鼠剖杀，取出子宫及胎盘组织，统计胚胎着床数并称重，另采用苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）法对胎盘组织进行染色，并采用ImageJ软件测量胎盘海绵体滋养层细胞的面积［5］。②于GD21各组再随机抽取10只孕鼠剖杀，收集2组孕鼠血清，采用放射免疫法检测血清25（OH）D浓度，另分别统计2组的胎数、吸收胎数、死胎数、活胎数、孕期增重、胎鼠体重、胎盘重量、身长、尾长、头围直径以及胸围直径。

1.4 统计学方法

本研究所得数据采用SPSS 19.0统计学软件给予处理，计量资料采用（±s）表示，检验方法为t检验，计数资料采用率（％）表示，检验方法采用χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 2组孕鼠GD13的受孕情况比较

GD13时，VDD组孕鼠的胚胎着床数（9.52± 1.75），显著低于Control组的（13.34±2.16）（P＜0.01），见图1A；VDD组孕鼠的胎儿流产率明显上升，见图1B；VDD组孕鼠的胎盘重量为（0.058 7±0.017 6）g，显著低于Control组的（0.078 6±0.014 3）g（P＜ 0.01），见图2；VDD组孕鼠的胎盘海绵体滋养层细胞面积为（86.20±6.06）％，显著小于Control组的（100.00±4.51）％（P＜0.01），见图3。

2.2 2组孕鼠GD21的血清维生素D含量比较

GD21时，VDD组孕鼠的血清25（OH）D浓度为（6.32±0.51）nmol/m L，Control组孕鼠的血清25（OH）D浓度为（13.46±0.62）nmol/m L，组间比较Control组显著更高，有统计学意义（t=33.311，P＜0.01），见图4。

2.3 2组孕鼠GD21的胚胎发育及妊娠结局比较

GD21时，与Control组比较，VDD组的活胎数、孕鼠孕期增重、胎鼠体重、胎盘重量及胎鼠身长显著降低（P＜0.01），吸收胎数与死胎数显著增加（P＜0.05或P＜0.01），见表1、图5。

表1 2组孕鼠GD21的胚胎发育及妊娠结局比较（±s）Table 1 Comparison of embryonic development andpregnancy outcome of 2 groups of pregnant mouse with GD21（±s）

表1 2组孕鼠GD21的胚胎发育及妊娠结局比较（±s）Table 1 Comparison of embryonic development andpregnancy outcome of 2 groups of pregnant mouse with GD21（±s）

测量指标胎数（只）吸收胎数（只）死胎数（只）活胎数（只）孕期增重（g）胎鼠体重（g）胎盘重量（g）身长（cm）尾长（cm）头围直径（cm）胸围直径（cm）Control组13.1±1.3 0.2±0.1 0.2±0.1 12.5±0.8 110±13 6.1±0.4 0.103±0.002 5.21±0.33 1.48±0.18 0.83±0.13 1.03±0.25 VDD组11.6±2.9 0.3±0.1 0.9±0.5 11.0±1.8 83±18 4.5±0.5 0.071±0.048 4.59±0.54 1.40±0.23 0.76±0.18 0.95±0.31 t P 1.493 2.236 4.341 2.408 3.845 7.902 2.106 3.098 0.866 0.997 0.635＞0.05＜0.05＜0.01＜0.05＜0.01＜0.01＜0.05＜0.01＞0.05＞0.05＞0.05

3 讨论

关于孕妇体内需要维持的正常维生素D水平目前尚存在一定争议，但相关权威机构如国际骨质疏松基金会与国际内分泌学会均建议至少应不低于30 ng/m L［6-7］。有学者［8］通过meta分析发现，与正常女性比较，血清25（OH）D水平低于20 ng/m L的女性群体其临床受孕率及胎儿活产率均显著降低。一项经美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）注册的随机对照研究显示［9］，将孕妇的血清25（OH）D水平维持在32 ng/m L以上几乎可完全避免不良妊娠结局的发生且具良好稳定性。这些结果我们可结合维生素D对女性生殖系统功能的影响给予解释。活性维生素D在人体内发挥生物作用首先是基于其与维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）的结合。而相关研究发现，VDR在女性卵巢、子宫内膜、输卵管上皮细胞、胎盘以及蜕膜上均有不同程度表达，同时其表达量还将伴随妊娠而增加［10］。与此同时，在人体骨骼、乳腺、胎盘以及子宫内膜中均发现存在有维生素D代谢的关键酶1α-羟化酶，且活性维生素D与体内胎盘中催乳素及人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）合成及分泌有关。另有动物实验发现，在卵巢颗粒细胞中有观察到VDRmRNA表达且其表达水平与卵泡发育具关联性，同时该研究还进一步揭示维生素D对颗粒细胞中抗苗勒管激素（评估卵巢储备功能的指标）水平具调节作用［11］。国外有学者［12］将小鼠VDR受体基因突变使其缺陷后发现，观察组小鼠的子宫发育完整性显著不及对照组并伴随出现不孕，提示维生素D参与了小鼠子宫的发育及成熟。目前业已证实，HOXA-10基因在胚胎的着床及分裂过程中发挥有重要作用，而有研究发现，活性维生素D作用于子宫内膜间质细胞可明显增加HOXA-10mRNA蛋白表达水平［13］。综合上述研究，可以认为维生素D可从多途径对女性生殖系统功能产生影响。本研究成功构建了维生素D缺乏小鼠模型，结果显示，在GD13时，与Control组比较，VDD组雌鼠的胚胎着床数显著降低，胎儿流产率明显上升，胎盘海绵体滋养层细胞面积显著减小，组间比较均有统计学意义（P＜0.01），进一步证实孕前母体低维生素D水平可导致受孕力降低。

本研究结果还显示，GD21时，与Control组比较，VDD组的活胎数、孕鼠孕期增重、胎鼠体重、胎盘重量及胎鼠身长显著降低（P＜0.01），吸收胎数与死胎数显著增加（（P＜0.05或P＜0.01）。此部分结果反映了维生素D缺乏与IUGR及宫内死亡的发生应存在关联，然而其具体机制目前尚不清楚。结合本次实验中的胎盘情况以及近期多位学者的一系列研究可初步确认，胎儿宫内生长受限原因有：胎儿本身因素（染色体异常、病毒感染等），母体因素（慢性疾病、营养不良、胎盘因素、脐带因素），胎盘发育受损和功能障碍是引起胎儿宫内生长受限的重要原因之一［14］。胚胎和胎儿生长发育所需的营养（如必需氨基酸、糖和必需脂肪酸等）主要由胎盘转运，而且，胎盘还分泌生长激素或生长因子（如胰岛素样生长因子IGFs等）；胎盘还可对母体内一些可损害胚胎和胎儿生长发育的有害物质起到屏障作用。一旦胎盘的发育以及功能受损，胚胎以及胎儿的正常发育必然遭受损害，继而导致胚胎和胎儿宫内生长受限。

一些小小样本研究证明：分娩小于胎龄儿的孕妇血清维生素D水平明显低于分娩正常体重的孕妇，证明维生素D缺乏与早产、流产、胚胎停止发育有关［15］，还有研究结果显示：与单纯l，25（OH）2D3培养组相比，对照组VDRmRNA水平并未表现有明显的下降趋势，故认为维生素D缺乏可能并非通过直接作用而可能是通过某种介质间接作用来对胎盘的发育与功能造成损害。关于此方面，目前多方研究证实，炎症因子可能是导致胎盘发育受损和功能障碍的重要原因之一。如有学者［16］发现，在接受Tbll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）的外源性天然配体-细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）处理后，孕鼠胎盘组织中的tnf-α以及il-6等促炎细胞因子基因的表达将显著上调，胎盘均重降低继而诱发胎儿宫内生长受限。此外，在对体外人胎盘线毛膜滋养细胞加入LPS或肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）孵育时，发现滋养细胞对叶酸的吸收能力显著下降。其中，LPS可抑制人胎盘滋养细胞合成和分泌IGF-1；而另一方面，有研究资料证实［17］，TNF-α在炎症介导的胎儿死亡和生长发育迟缓发生过程起关键作用。综上所述，孕鼠血清维生素D缺乏可能并非通过直接抑制胎盘细胞增殖生长，而是增强体内炎性因子表达，增加体内炎症反应继而抑制胎盘滋养细胞增殖，最终导致IUGR发生。

综上所述，本研究所构建的维生素D缺乏小鼠模型提示：母体维生素D缺乏是导致小鼠受孕力水平降低及妊娠后胚胎发育迟缓的重要影响因素之一，在孕前及孕期科学补充维生素D对提高育龄期小鼠受孕力水平及保障妊娠后胚胎良性发育具有重要意义。

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Effect of vitamin D deficiency on the pregnancy and embryonic development in mouse model

WANG Bo，WANG Xueyun★
（Obstetrics and Gynecology Department，Huai’an First People’s Hospital，Nanjing Medical University，Huai’an，Jiangsu，China，223300）

Objective To study the effect of vitamin D deficiency on the potential to conceive and embryonic development through establishing amouse model.Methods Digital random method was used to divide the female mice into the vitamin D deficient（VDD）group and the control group.The individuals of the VDD group were fed with low levels of vitamin D diet，and the Control group received a standard diet.After 2 weeks，the mice were mated.Results At GD13，embryo implantation number of pregnant mice of VDD group（9.52±1.75）were significantly lower than that of Control group（13.34±2.16）（P＜0.01）；abortion rate of pregnant mice of VDD group were significantly increased；placental weight of pregnant mice of VDD group（0.058 7±0.017 6）g were significantly lower than thatof Control group（0.078 6±0.014 3）g（P＜0.01）；placental trophoblast cells of corpus cavernosum area in pregnant mice of VDD group were（86.20±6.06）％，significantly lower than that of Control group（100.00±4.51）％（P＜0.01）.AtGD21，serum 25（OH）D concentration of pregnant m ice of VDD group was（6.32±0.51）nmol/m L.However，serum 25（OH）D concentration was significantly higher in Control group（13.46±0.62）nmol/m L（P＜0.01）.Compared with the Control group，the number of live fetuses，pregnant mouse weight，fetal weight，placental weight and fetal length in VDD group were significantly decreased（P＜0.01），and the number of dead and absorbed fetus were significant increased（P＜0.05 and P＜0.01respectively）.Conclusion Maternal vitamin D deficiency is one of the important factors resulting in the reduced pregnancy force level and stunted embryonic development in post-pregnancy mouse.So the supply of vitamin D is essential for the mouse of childbearing age during the pre-pregnancy and pregnancy period，which can significantly increase the potential to conceive and guarantee benign post-pregnancy embryonic development.

Vitamin D；Pregnancy force；Embryonic development；Animal model

南京医科大学附属淮安第一医院妇产科，江苏，淮安223300

★通讯作者：王雪云，E-mail：365987071@qq.com