基于指纹图谱的生物体系中药内禀品质等级的数理理论判别

邹　华　彬

(山东大学化学与化工学院，济南，250100)



中药研究

基于指纹图谱的生物体系中药内禀品质等级的数理理论判别

邹华彬

(山东大学化学与化工学院，济南，250100)

品质等级理论；生物信息论；十全大补丸；指纹图谱；模式识别；鉴别

多年来对中医药的持续深入思考及系统研究，作者认为中医药现代研究可初步归结为以下几大核心科学问题：1)中药内禀品质及品质等级理论判别；2)中药有效成分的精确判别；3)人体病证分子层次的系统精确诊断；4)人体疾病产生发展的分子层次机制；5)中药药性物质及其治疗疾病的分子层次的系统机制。中药品质精确判别又是其他几个核心问题的基础。

中药治疗疾病的最直接的物质基础是其中所含有的各类化学成分。由于受到内在基因变异、环境条件变化及加工、保存技术方法等诸多因素的影响，其品质及疗效都会显著地发生变化。中药复方由多味中药材组成，这可能会导致不同厂家的同一配伍组成的中药复方的品质具有比单味药材更加显著的变化范围。

中药的同一成分针对不同的疾病一般具有多效性，因此，目前法定采用一种或几种成分的含量来评价中药的质量[1]，无法得到准确的质量评价结果。

中药存在着客观的品质等级。为了保证中药的品质及其临床治疗疾病的有效性、药理研究的可靠性,建立生物体系品质及品质等级的数理理论对中药品质进行准确定量分析判别，是中医药现代研究的核心课题之一，具有极其重要的理论意义及应用价值。

目前中药品质等级研究可分为2个方面，1)中药材品质等级，目前主要是依据品种、产地、尺寸、多种宏观性状及单位质量药材所包含的个数来确定其品质等级[2-4]，这些外观性状不能准确反映中药的内在品质。生物效价法亦用于研究不同产地的中药材的品质[5-6]。2)中药复方品质等级研究，利用液相色谱指纹图谱及人为主观确定的参数值标准对不同厂家的复方进行品质等级研究，难以保证准确反映其品质的实际差异[7]。无论是中药材还是中药复方，目前尚缺乏品质等级数理基础理论的研究。

中药品质评价研究的发展趋势是发展符合中药内禀生物学特性规律的数理方法，基于中药自身可以反映内在品质的全成分含量及结构信息，获取能够无偏代表其品质特征的量化指标，摆脱主观经验，实现对中药品质的无偏评价。关于十全大补丸的鉴别及质量评价研究主要采用HPLC[7-11]、TLC[12]法或毛细管电泳法[13]测定其中的一种或几种成分含量。

生物代谢物及次生代谢物指纹图谱反映了其品质信息，指纹峰的稳定性与其品质的稳定性直接相关。对中药指纹图谱的系统深入研究表明，红外、色谱、磁共振成像及紫外指纹图谱中的峰位信息较峰高度或峰面积信息，更能准确反映中药的品种品质信息，可以基于此类信息构建生物体系内禀品质等级理论。

本研究提出并建立生物体系内禀品质等级理论。包括2个步骤，首先根据作者建立的相同品质中药的系统理论判别方法[14]，在品种品质层次上实现对不同中药品种的精确鉴别分类，再依据分子层次性状稳定性与品质稳定性直接相关的生物基本性质，建立了以分子层次性状频率为自变量的生物体系品质描述函数及不同品质等级的数理标准。

补中益气丸和十全大补丸皆由10种中药组方，且2者有5种主要的药材相同，这使其鉴别及质量控制较困难。本研究测试了不同中药厂家生产的22个十全大补丸及9个补中益气丸样品的氯仿提取物的红外指纹图谱,对两类组成非常相似的中药复方品种进行了精确鉴别，正确识别率为100%，然后基于中药品质等级数理理论分析了样品的指纹图谱数据并进行了品质等级理论判别。结果表明，不同厂家的22个样品在理论上皆为优级品(脂溶性提取物)，但他们存在小的差异。

1　中药品质等级数理理论的建立

根据指纹图谱峰频率建立中药品质等级数理理论及标准。

1.1基于中药内在品质对中药进行精确鉴别分类根据作者博士期间独立提出及建立的中药质量控制多维指纹图谱共有峰率和变异峰率双指标序列分析法(简称双指标序列分析)[15-16]，及后来建立的双指标信息理论方程[17]。

I=PglnPg+PalnPva+PblnPvb

建立了相同品质中药的系统理论判别方法[14]，在中药的品种品质层次进行精确鉴别分类。

1.2建立中药品质描述函数在基于生物体系内禀品质规律对中药品种进行精确鉴别的基础上，根据同品种样品的指纹图谱构建中药品质描述函数，表示如下：q=q(f1,f2，f3,…，fi)，(1)，其中q是品质函数；f1，f2，f3,…，fi：同品种的不同中药样品中，每个指纹峰出现的频率。fi的值越高，说明该指纹峰出现的机会越多，该指纹峰对应的分子或分子结构越能反映样品的品质特性。反之，fi的值越低，说明该指纹峰出现的机会越少，越不能反映中药的品质特性。频率较高部分的指纹峰群可以反映并代表中药的品质特性。

以此建立的理论分析方法，对品质描述函数q=q(f1,f2，f3,…，fi)进行分析。对于使中药品质描述函数q(f1,f2，f3,…，fi)发生显著变化的fk，说明在该频率前后，中药品质发生显著地变化且品质不同。根据不同的中药品质突变频率，建立不同中药品质等级的频率边界值及频率范围，如下所示：Fj，j=1，2，…，F1>F2>F3，…(3)j代表中药品质等级，F1，F2，…，分别对应于第一、第二、…，品质等级的频率边界值。作者的理论分析表明(另有专文待发表该理论)，不同品质等级的指纹峰频率参数。见表1。

表1　生物体系不同品质等级的频率分布

1.4建立中药品质等级的理论判别标准根据(1.3)中建立的不同品质等级的频率边界值：Fj，j=1，2，…，在相同品种中药的指纹图谱中，确定fj≥F1的指纹峰组，作为该中药的优级品质特征峰群，fj≥F2的指纹峰组，作为该中药的良级品质特征峰群，j越大，说明品质越低。

另外,由于生物生长过程中及加工过程的随机波动性，同属于一个等级的不同样品所具有的该等级品质的指纹峰数也会发生一定的变化，在何种变化范围内的样品属于同一等级。根据反映生物内在本质特性的双指标信息理论方程[17]，依据其得到的相同品质生物体系的理论标准是它们的指纹图谱相似度Pg≥61%[14]，该指标可以作为生物体系相同品质等级的理论判别标准。不同品质等级个体样品的理论判别规则建立如下。

在各品质等级中，判别标准Pg=61%～100%，显示出同一理论品质等级中的样品还是存在品质的较宽分布范围。若将各品质等级的范围细分为2个区间，Pg=61%～80%，Pg=81%～100%，可以合理精细地表征每个样品的品质等级，不同品质等级细化标准表示。见表2。

表2　细化品质等级标准

品质等级判别的顺序是：依次进行优级、良级、中级、合格级判别。这些品质等级具有排它等级性。

2　材料与方法

2.1仪器美国NICOLET-5700-FT-IR傅立叶变换红外光谱仪,光谱范围：4 000 cm-1～ 400 cm-1，分辨率4 cm-1。高速粉碎机，紫外分光光度计(UV-240,日本岛津)，分析天平(精确度0.001 g)。

2.2中药样品及试剂三氯甲烷(天津科密欧化学试剂有限公司，A.R.)。十全大补丸样品：兰州太宝制药有限公司S1,S2(生产日期2007.07.24，批号59071123)；北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂S3，S4(2006.12.04，6034209);S5～S9(2008.01.09，8030955)；河南宛西制药股份有限公司S10～S12(2003.09.22，030901)；S13,S14(2006.04.29，060402);S15,S16(2007.07.14，070701);S17,S18(2007.07.31，070702);S19,S20(2007.08.23，070801);S21，S22(2008.03.15，080301)。补中益气丸样品：湖北瑞药药业有限公司S23，S24(2006.10.07，061001)，马鞍山神鹿科瑞有限公司S25(2007.05.28，20070545),S26(2008.01.05，20080108);兰州太宝制药有限公司S27(2007.05.28，83071462)，S28(2007.06.14，83071463);湖北清达药业科技有限公司S29(2005.03.19，050302)，S30(2006.03.16，060301);北京同仁堂科技发展股份有限公司S31(2007.04.10，7080264)。

2.3最佳提取条件采用索氏提取器加60 mL氯仿回流提取十全大补丸0.5 g粉末中脂溶性成分，最佳提取时间为1.5 h。

2.4测试样品的制备及测试条件每个样品平行称取3份粉末，2.00 g/份，得3份提取物，每份提取物平行测量3次，共得9个指纹图谱，取其中每组共有峰的平均波数构成各个样品的组合指纹图谱，作为十全大补丸品质等级分析的基础数据。方法同文献[21]。

2.5重复性及稳定性试验十全大补丸样品氯仿提的红外指纹图谱具有良好的重复性及稳定性。

3　红外指纹图谱及十全大补丸品质等级分析

3.1十全大补丸及补中益气丸氯仿提取物红外指纹图谱十全大补丸及补中益气丸氯仿提取物红外指纹图谱见图1。

图1　十全大补丸及补中益气丸氯仿提取物红外指纹图谱叠加图

注：3 400 cm-1处，由下到上依次为十全大补丸S1，S3，S5，S10,S15,S21，补中益气丸S31，S29，S27,S25,S23。

由图1可知，十全大补丸与补中益气丸氯仿提取物的红外指纹图谱具有高度的相似性及复杂性，难以直观区分它们，需要采用数理理论来加以精细分析。根据共有峰及变异峰的理论判别法-Shaprio-Wilk W检验判别法，来确定不同样品红外指纹图谱中的共有峰及变异峰。

3.2十全大补丸与补中益气丸品种精确鉴别分类根据相同品质中药的系统理论判别方法[14]，基于内在品质规律而不是外观性状对十全大补丸及补中益气丸进行了精确分类，在Pg≥58%(根据相同品质中药的系统理论判别方法，相同品质中药的相似度范围x≤Pg≤100，x=58%～64%)，31个样品的特征序列如下，样品的正确识别率为100%。

十全大补丸的特征序列

S1:(S1)aS2S21 S22b

S2:S1(S2)S15 S10

S3:(S3)S4 S5 S6 S7S8 S9 S12 S13 S14

S4:S3(S4)S5 S6 S7 S8 S9 S12 S13 S14

S5:S3 S4(S5)S6 S7 S8 S9 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S21 S22

S6:S3 S4 S5(S6)S7 S8 S9S12 S13 S14

S7:S6 S3 S4 S5(S7)S9 S8 S13 S12 S14

S8:S3 S4 S5 S6 S7(S8)S9 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S19 S21 S22

S9:S3 S4 S5 S6 S7 S8(S9)S11 S12 S13 S15 S16

S10：(S10)S12 S14 S15 S16 S19 S20 S21 S22

S11:S5 S8 S9(S11)S12 S13 S14 S15 S19 S21 S22

S12:S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11(S12)S13 S14 S15 S16 S20 S19 S21 S22

S13:S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S11 S12(S13)S14 S15 S16 S20 S21 S22

S14：S3 S4 S5 S6 S7 S8 S10 S11 S12 S13(S14)S15 S16 S20 S21 S22

S15:S5 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14(S15)S16 S19 S20 S21 S22

S16:S5 S8 S9 S10 S12 S13 S14 S15(S16)S20 S21 S22

S17:S8(S17)S18 S19 S21 S22

S18:S17(S18)S19 S21 S22

S19:S8 S10 S11 S12 S15 S17 S18(S19)S20 S21 S22

S20:S10 S12 S13 S14 S15 S16 S19(S20)S21 S22

S21:S5 S8 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20(S21)S22

S22:S5 S8 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21(S22)

补中益气丸的特征序列

S23:(S23)S24 S31

S24:S23(S24)

S25:(S25)S26 S29

S26:S25(S26)S27 S28

S27:S26(S27)S28

S28:S26 S27(S28)

S29:S25(S29)S30

S30:S29(S30)

S31:S23(S31)

a.S1:(S1)aS2，S1的特征序列，其中S1属于自身的最相似样品，构成其特征序列的成分，其他样品各自构成自身特征序列的成分。b.S21 S22.是紧邻S1特征序列的非特征序列样品，它们的Pg<58%，因S21S22与S1S2同属于十全大补丸，这说明S1S2与S3～S22，确实属于同类，但特征序列体现出统计学意义。

2个组成非常相似的中药品种的特征序列之间没有交叠，十全大补丸S1～S22的特征序列完全由S1～S22构成，而补中益气丸S23～S31的特征序列完全由S23～S31构成，实现理想的分类模式识别。

3.3十全大补丸品质等级数理理论分析结果根据本文建立的中药品质等级数理理论分析方法，对3个不同厂家的22个十全大补丸样品的氯仿提取物的红外指纹图谱进行分析。各个共有吸收峰波数对应的峰频率见表3。

表3　十全大补丸氯仿提取物的红外指纹图谱峰对应的频率

根据表3的数据，可以计算平均频率=8.92，标准偏差Sf=8.06，由此得不同品质等级样品的频率边界及范围。及其对应的指纹峰。见表4。

表4　十全大补丸不同品质等级样品指纹峰频率区间及其对应的指纹峰群

表5　十全大补丸样品不同品质等级指纹峰频率及品质等级

根据双指标信息理论方程[17]，可以推出，当2个样品的相似度Pg≥61%,2个样品具有相同的品质。根据这一理论结果，建立公式(4)～(7)，可以判断每个样品的质量等级。十全大补丸样品优、良、中级及合格等不同品质等级指纹峰频率f优，f良，f中，f合格及样品的品质等级，根据表2中确定的品质等级细化判别规则，22个十全大补丸的品质等级判别结果见表5。

表5分析结果显示，虽然S1,S2与S3～S22有微小的差异，3个厂家生产的22个十全大补丸产品，皆为优级品，说明3个厂家产品具有优良的稳定性，品质一致性。根据表2，则可将S1,S2 2个样品确定为优级-，而S3～S22确定为优级+，这也与它们的特征序列具有一定的差异相吻合。

4　结论

本研究建立的生物体系内禀品质等级数理理论，实现了中药生物体系品质等级的严谨理论判别，突破了几千年来中药品质等级确定只能依赖于经验知识及主观规定的局限性。该理论方法的每个环节都基于严谨的理论基础，因而对中药品质等级的理论判别结果具有科学合理性。建立的基于指纹图谱峰频率的品质等级描述方法，具有一定的创新性。该方法理论上适用于所有种类的生物体系，包括中药材、中药复方品质等级的理论分析，为解决中药品质的客观精确定量评价问题探索了一条新的可行路径。该理论方法确定的优级品质分子性状亦可以作为生物体系的特征标记群,用于生物体系的快速准确定性鉴别。

致谢：本研究论文的部分原始数据采自作者2007级硕士研究生董凤娟的毕业论文。

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(2015-10-12收稿责任编辑：徐颖)

Fingerprint Spectra-based Mathematical Theory in Determining the Intrinsic Quality Grade of Biological System of Chinese Medicine

Zou Huabin

(School of Chemistry and Chemical Engineering of Shandong University, Jinan 250100, China)

Quality grade theory; Biological information theory; Shiquan Dabu pills; Fingerprint spectra; Pattern Recognition; Identification

山东省中医药科技发展计划项目(编号：2013-157)

邹华彬，博士，副教授，硕士研究生导师，研究方向：中药鉴别及质量评价理论方法学研究，E-mail：huabinzou@126.com

R286.0

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.09.060