桔梗不同配伍对乳腺癌高转移潜能细胞4T1增殖及侵袭的影响

吴金娜　龚旭初　陈海东　杨万富　刘　胜

(1 江苏省南通市中医院中医外科，南通，226001； 2 上海中医药大学附属龙华医院中医外科，上海，200032)



桔梗不同配伍对乳腺癌高转移潜能细胞4T1增殖及侵袭的影响

吴金娜1龚旭初1陈海东1杨万富1刘胜2

(1 江苏省南通市中医院中医外科，南通，226001； 2 上海中医药大学附属龙华医院中医外科，上海，200032)

目的：应用MTT比色法及Transwell试验检测桔梗配伍不同中药对乳腺癌高转移潜能细胞4T1增殖及侵袭能力的影响。方法：给予SD大鼠中药煎剂灌胃，制备含药血清。应用MTT比色法检测桔梗不同配伍含药血清对4T1细胞增殖的影响；应用Transwell实验检测桔梗不同配伍含药血清对4T1细胞侵袭能力的影响。结果：桔梗及桔梗配伍不同中药组含药血清干预24 h后，对4T1细胞的增殖均有一定的抑制作用。各组含药血清对乳腺癌高转移潜能细胞4T1的增殖抑制率分别为桔梗组30.75%、桔梗加麦冬组34.44%、桔梗加蛇床子组44.71%、桔梗加莪术组49.84%。Transwell实验结果显示，桔梗及桔梗配伍不同中药各组均能降低透过小室的4T1细胞数，对于乳腺癌高转移潜能细胞4T1的侵袭能力有显著的抑制作用，同模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。同桔梗单用组比较，桔梗配伍不同中药组的抑制作用较强，其中桔梗配伍麦冬组及桔梗配伍蛇床子组效果显著，差异有统计学意义(P<0.01)，桔梗配伍莪术组在抑制作用方面虽然由于桔梗单用组，但差异无统计学意义(P>0.05)。结论：桔梗及桔梗配伍不同治则中药对乳腺癌高转移潜能细胞4T1的增殖及侵袭有不同程度的抑制作用。

桔梗；配伍；4T1细胞；肺转移

现今社会中，乳腺癌是严重威胁妇女健康的恶性肿瘤之一，对妇女的健康影响巨大[1]，是美国女性癌症死亡的第二大因素[2]，亚洲发病率虽然最低[3]，但我国的乳腺癌发病率一直处于上升阶段[4]，2011年统计，乳腺癌居我国女性肿瘤发病率之首[5]。随着医学诊疗手段的发展，早期乳腺癌的治愈率在逐年提高，但转移性乳腺癌的治疗进展缓慢，对患者的危害极大，其中15%～25%的转移性乳腺癌为肺转移，仅次于骨转移居转移性乳腺癌的第2位[6-7]。因此，研究乳腺癌肺转移发生发展的机制[8]，发掘能够有效对抗肺转移的中药药对或中药单药，对乳腺癌肺转移的临床治疗意义重大。

我们研究组在“从化”理论及“归经”理论的指导下，根据乳腺癌肺转移的病机特点，从扶正祛邪角度出发观察桔梗[9]、桔梗分别配伍麦冬、蛇床子、莪术对乳腺癌肺转移的影响。通过MTT及Transwell观察各组含药血清对乳腺癌高转移潜能细胞株4T1增值及侵袭的影响。

1　实验材料

1.1仪器和试剂胎牛血清(Gibco，USA)；1640培养基(Gibco，USA)；胰蛋白酶(Gibco，USA)；四甲基偶氮唑盐(MTT)(Sigma，USA)；二甲基亚砜(DMSO)(Sigma，USA)；Forma Series 11 CO2培养箱(Thermo Electron Corporation，USA)；Forma Class Ⅱ B2生物安全柜(Thermo Electron Corporation，USA)；Multiskan MK3多功能酶标仪(Thermo Labsystems，USA)；Image-Pro Plus 6.0图像分析系统(Media Cybernetics，USA)。

1.2实验药物桔梗(产地安徽，由上海养和堂中药饮片公司加工，购自龙华医院中药房)；麦冬(产地四川，由上海养和堂中药饮片公司加工，购自龙华医院中药房)；蛇床子(产地山东，由上海养和堂中药饮片公司加工，购自龙华医院中药房)；莪术(产地广西，由上海养和堂中药饮片公司加工，购自龙华医院中药房)；生理盐水(无锡华裕制药有限公司，批号：11062002)。

1.3实验细胞系小鼠乳腺癌高转移潜能4T1细胞由中国科学院上海细胞库提供，将其置于50 kU/L青霉素及50 mg/L链霉素、10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，在37 ℃、5% CO2条件下培养。

1.4实验动物雌性SD大鼠50只，SPF级，体重(280±20)g，购于中国科学院上海实验动物中心，许可证号：SCXK(沪)2007-0005。室温下饲养于上海中医药大学附属龙华医院实验动物中心，自由进水及取食。

2　实验方法

2.1药物血清的制备将SD大鼠随机分为5组，每组10只，按照人鼠等效剂量[10]给药。每只大鼠每次给药生药量为：桔梗组3 g/kg、桔梗加蛇床子(3+4.5)g/kg、桔梗加麦冬(3+4.5)g/kg、桔梗加莪术(3+6)g/kg。分早晚2次灌胃给药，连续3 d后，末次给药1.5 h后用3%戊巴比妥钠溶液予腹腔注射麻醉实验动物，具体用药量为100 g体重给予1 mL。待大鼠麻醉后，采取腹主动脉取血，将取得血液置于离心管中，室温下静置4 h后，3 000 r/s离心机中离心10 min，无菌分离血清，将同组10只大鼠血清充分混合，通过0.22 μm过滤膜过滤后，置于56 ℃水浴中灭活30 min，-80 ℃冰箱保存以备后用。

2.2Transwell将Matrgel胶用1640培养基以1∶2的浓度稀释，将混合液均匀铺于Transwell小室内，剂量为70 μL/室，后将Transwell上下室置于1640培养基中过夜水化；取对数生长期的4T1细胞接种于6孔培养板中，按照实验分组加入含药血清配置的培养基，24 h后抽吸上清液后消化细胞，先用PBS液(Phosphate-buffered Saline，磷酸盐缓冲溶液)冲洗2遍，后将细胞重悬于1640培养基中，显微镜计数并调整细胞浓度为5×105个/mL；将药物血清干预后的各组细胞悬液加入Transwell小室的上室，每个小室为100 μL，各组取3个复孔，在下室中加入含10%胎牛血清的1640培养基，每个下室剂量为500 μL，将Transwell放入培养箱中培养24 h。抽吸Transwell上室及下室的培养基后，小心取出小室用棉签轻轻搽掉小室底部的Matrigel胶，用PBS溶液清洗小室3次，后加4%多聚甲醛固定20 min，抽吸多聚甲醛，用蒸馏水洗小室2 min×2，加入苏木素染色5 min，用自来水反复冲洗去掉多余染色液，再用蒸馏水清洗1次，加95%乙醇5 s后弃去，用依红染色15 min，取70%乙醇清洗2次。最后用手术刀片将小室底部的薄膜沿边缘小心割下，将薄膜的下表面朝上置于载玻片上，盖上盖玻片。置于200倍倒置显微镜下计数穿孔的细胞，每个样本选择5个不同方向的视野。

2.3桔梗配伍不同中药对乳腺癌癌转移潜能细胞4T1增殖活性的影响将对数生长期的乳腺癌高转移潜能细胞4T1消化计数后，以1640培养基调整细胞浓度浓度至1×105个/mL，将细胞重悬取细胞悬浮液200 μL/孔接种于96孔培养板，每组5个复孔，至于36 ℃，5% CO2培养箱，培养至80%的4T1细胞在融合状态下，而后抽吸原培养液并加入各组含有药物的血清，再培养细胞24 h，在培养板上加5 g/L的MTT试剂，150 μL/孔，再培养4 h后抽吸培养板中的上清液，取二甲基亚砜100 μL/孔加入各个培养板孔洞中，震荡10 min。将培养板放置入酶标仪中测定以490 nm波长，测定各个培养孔的光密度(Optical Density，OD)值，计算细胞的增殖抑制率，公式如下。

4T1细胞的增殖抑制率=(1-给药组OD/对照组OD)×100%

表1　桔梗配伍不同中药含药血清对4T1细胞增殖的抑制

注：同对照组比较，**P<0.01；同桔梗组比较，□P<0.05，□□P<0.01；同桔梗加麦冬组比较，▲P<0.05。

图1　桔梗配伍不同中药含药血清对4T1细胞增殖的影响(OD值)

注：control:对照；pal：桔梗；Oph：麦冬；Cni：蛇床子；Rhi：莪术。同模型组比较，**P<0.01。

3　结果

3.1桔梗配伍不同中药含药血清对4T1细胞增殖的抑制作用桔梗及桔梗配伍不同中药组含药血清干预24 h后，对4T1细胞的增殖均有一定的抑制作用。同模型组比较，其他各组含药血清OD值明显降低(P<0.01)；同单用桔梗组比较，桔梗加蛇床子的OD值显著降低(P<0.05)，桔梗加莪术组的OD值更低(P<0.01)，而桔梗加麦冬组的OD值虽然较桔梗单用低，但差异不明显(P>0.05)；同桔梗加麦冬组比较，桔梗加莪术组的OD值也显著降低(P<0.05)。各组含药血清对乳腺癌高转移潜能细胞4T1的增殖抑制率分别为桔梗组30.75%、桔梗加麦冬组34.44%、桔梗加蛇床子组44.71%、桔梗加莪术组49.84%。见图1、表1。

图2　桔梗配伍不同中药Transwell图片

组别N(复孔)细胞数模型组15(3)5580±2569桔梗15(3)2060±826∗∗桔梗加麦冬15(3)707±228∗∗□□桔梗加蛇床子15(3)733±250∗∗□□桔梗加莪术15(3)1267±850∗∗

注：同模型组比较**P<0.01；同桔梗组比较□□P<0.01。

图3　桔梗配伍不同中药对4T1侵袭能力的影响

注：control:对照；pal：桔梗；Oph：麦冬；Cni：蛇床子；Rhi：莪术。同模型组比较**P<0.01。

3.2Transwell实验结果结果显示，桔梗及桔梗配伍不同中药各组均能降低透过小室的4T1细胞数，对于乳腺癌高转移潜能细胞4T1的侵袭能力有显著的抑制作用，同模型组比较具有显著有统计学意义(P<0.01)。同桔梗单用组比较，桔梗配伍不同中药组的抑制作用较强，其中桔梗配伍麦冬组及桔梗配伍蛇床子组效果显著(P<0.01)，桔梗配伍莪术组在抑制作用方面虽然由于桔梗单用组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2，图2、图3。

4　结论

从上述实验结果可以看出，桔梗含药血清对于4T1细胞的增殖具有抑制作用，且在配伍麦冬、莪术、蛇床子后，其含药血清的抑制作用更强，特别是桔梗配伍莪术组，效果显著。在抑制细胞侵袭方面，桔梗单用组含药血清同对照组比较差异有统计学意义，且配伍不同中药后，效果更为明显，其中桔梗配伍麦冬及桔梗配伍蛇床子组效果最优。

综上所述，中药桔梗配伍不同治则含药血清对4T1细胞的增殖及侵袭确有不同程度抑制作用，其具体作用机制仍需进一步实验研究。

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(2015-01-27收稿责任编辑：张文婷)

Effect of Platycodon in Different Combination with Active Ingredients of Chinese Herbs on Multiplication and Metastasis of 4T1 Cell Line

Wu Jinna1，Gong Xuchu1，Chen Haidong1，Yang Wanfu1,Liu Sheng2

(1 Institute of Traditional Chinese Medicine Surgery，Nan Tong Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nantong 226001，China；2InstituteofTraditionalChineseMedicineSurgery，LonghuaHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shanghai200032，China)

Objective:To study the effects of platycodon in different combination with active ingredients of Chinese herbs on multiplication and metastasis of 4T1 cell line by MTT assay and transwell method.Methods:Preparation of medicated serum through SD mouse which Stock diet was given with traditional Chinese medicine apozem by stomach tube.Effects of medicated serum on multiplication and metastasis of 4T1 cell line were detested by MTT assay and transwell method.Results:The medicated serum of platycodon in combination with different active ingredients of Chinese herbs may inhibit the proliferation of 4T1 cell line after 24 hours.The inhibition rate of platycodon was 30.75%，platycodon plus ophiopogon japonicas was 34.44%，platycodon plus cnidium monnieri group was 44.71%，and platycodon plus rhizoma curcumae was 49.84%.Platycodon and Platycodon in combination with different active ingredients of Chinese herbs all can reduce the number of 4T1 cell line of throug the chamber by transwell method，they can inhibite the metastasis of 4T1 cell line significantly(compared with control，P<0.01).The inhibition of Platycodon in combination with different active ingredients of Chinese herbs was stronger than that of the Platycodon，and the inhibition of platycodon plus ophiopogon japonicas and platycodon plus cnidium monnieri group showed statistically significant differences(compared with Platycodon，P<0.01).The inhibition of platycodon plus rhizoma curcumae was stronger than that of the platycodon，showing no statistically differences(P>0.05).Conclusion:Platycodon in combination with different active ingredients of Chinese herbs can inhibite the multiplication and metastasis of 4T1 cell line.

Platycodon； Combination； 4T1 cell line； Lung metastasis

国家自然科学基金项目(编号：81173269、81102598)；南通市卫生局青年(编号：WQ2014053)

刘胜(1968.08—)，男，博士，博士研究生导师，主任医师，上海中医药大学附属龙华医院党委书记，研究方向：中医药防治乳腺疾病，E-mail：laoda222@163.com

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.09.055