反相HPLC法测定复方芍红颗粒中芍药苷含量

甘　为　陈金凤　马桂芝.山东电力中心医院药剂科，山东济南500；.新疆医科大学第一附属医院药学部，新疆乌鲁木齐8300；3.新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐830054

反相HPLC法测定复方芍红颗粒中芍药苷含量

甘为1陈金凤2马桂芝3▲
1.山东电力中心医院药剂科，山东济南250011；2.新疆医科大学第一附属医院药学部，新疆乌鲁木齐830011；3.新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐830054

目的建立用于测定复方芍红颗粒中芍药苷含量的HPLC法。方法采用色谱柱Kromasil C18（4.6mm×250mm，5μm），以甲醇-水（40∶60）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长232 nm，柱温30℃。结果芍药苷检测浓度在0.008～0.512mg/mL范围内与峰面积呈良好线性（r=0.9998）；平均回收率为100.3%，RSD为1.38%；精密度、稳定性和重复性试验RSD均小于2%。含量测定平均值为17.54mg/g。结论该方法简单、快速，精密度高，重复性好，所建立的方法可以用于复方芍红颗粒中芍药苷的质量控制。

复方芍红颗粒；含量测定；RP-HPLC；芍药苷

复方芍红颗粒是据临床验方研发而成的中药新药，原方主要是由赤芍、红花、红景天、川芎四味药材组成，用于冠心病的治疗。方中赤芍（Paeonia lactiflora Pall）为君药，为毛茛科多年生草本植物，以干燥根入药，栽培品干燥根称之为白芍，野生品干燥根称之为赤芍［1］。赤芍，性微寒、微苦，具有清热凉血，散瘀止痛之功效，用于热入营血、温毒发斑、吐血衄血、目赤肿痛、肝郁胁痛、经闭痛经、癥瘕腹痛、跌扑损伤、痈肿疮疡［2-10］。赤芍的主要有效成分为芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷等多种苷类物质，总称为赤芍总苷，其中芍药苷为赤芍中含量较高的主要有效成分之一［11-12］。为了有效控制该制剂的质量，采用HPLC法对复方芍红颗粒中芍药苷进行含量测定。

1　仪器与材料

1.1仪器

LC20-AB高效液相色谱仪（日本岛津，SPD-20A检测器），KQ3200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），BS110S电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）。

1.2试药

甲醇（色谱级，Fisher公司），水为超纯水，芍药苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号0736-200014），复方芍红颗粒、缺赤芍阴性样品颗粒（课题组自制）。

2　方法与结果

2.1色谱条件

Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相：甲醇-水（40∶60），柱温30℃，检测波长232 nm，进样量10μL，流速1.0 mL/min［13-19］。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备

精密称取经减压干燥48h的芍药苷对照品5.08mg，加甲醇适量，超声使溶解，放冷，甲醇定容至25 mL，制成0.2032 mg/m L的溶液，用0.22μm微孔滤膜滤过，滤液作为对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备

取复方芍红颗粒0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称重，静置4 h，超声20min，放冷，用甲醇补足减失重量，过滤，取上清液，用0.22μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.2.3阴性对照溶液的制备

精密称取缺赤芍阴性样品颗粒0.2 g，其余方法同供试品溶液的制备。

2.3专属性考察

在“2.1”项下色谱条件下，芍药苷对照品色谱峰与供试品中其他色谱峰基线分离，分离度为1.33，拖尾因子1.04，颗粒中其他成分对芍药苷测定无干扰。

2.4线性关系

配制系列浓度芍药苷对照品溶液（8、32、64、128、192、256、384、512μg/m L），分别吸取10μL注入高效液相色谱仪进行测定，记录色谱图，以峰面积值（Y）对浓度（X）进行线性回归，回归方程为Y=15 851X+ 24 681（r=0.9998），芍药苷浓度在8～512μg/mL范围内峰面与浓度呈良好线性关系。

2.5供试品溶液制备方法的优选

2.5.1单因素试验

2.5.1.1提取溶剂浓度的选择精密称取0.2 g复方芍红颗粒6份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入10%、30%、50%、70%、90%、100%的甲醇10 mL，称定重量，超声提取30 min（功率100W，温度20℃）取出，放冷用相应溶剂补足减失重量，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，精密吸取上述溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱峰，不同浓度甲醇提取对芍药苷含量影响较大，采用100%甲醇提取时，芍药苷的提取率最高。

2.5.1.2提取溶剂加入量的选择精密称取7份0.2 g复方芍红颗粒，置具塞锥形瓶中，分别加入10、20、30、40、50、100、200 mL的甲醇溶液中，称定重量，超声提取30 min（功率100W，温度20℃）取出，放冷，用甲醇补足减失重量，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，精密吸取上述溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱峰，加入不同体积甲醇提取对芍药苷含量影响较大，采用1∶100的提取溶剂提取时，芍药苷的提取率最高。

2.5.1.3超声时间的选择精密称取6份0.2 g复方芍红颗粒，置具塞锥形瓶中，加甲醇溶解，定容，称定重量，分别超声10、20、30、40、50、60 min（功率100 W，温度20℃），取出，放冷用甲醇补足减失重量，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，精密吸取上述溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱峰，不同超声时间提取对芍药苷含量影响较大，超声时间为20 min时，芍药苷的提取率最高。

2.5.1.4超声温度的选择精密称取5份0.2 g复方芍红颗粒，置具塞锥形瓶中，加甲醇溶解，定容，称定重量，分别超声在20、30、40、50、60℃（功率100 W）超声20 min，取出，放冷，用甲醇补足减失重量，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，精密吸取上述溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱峰，不同超声温度提取对芍药苷含量影响较大，超声温度为50℃时，芍药苷的提取率最高。

2.5.1.5提取方式的选择精密称取3份0.2 g复方芍红颗粒，加甲醇溶解，定容，称定重量，分别超声，静置，回流提取20 min，取出，放冷，用甲醇补足减失重量，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，精密吸取上述溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱峰，不同提取方式对芍药苷含量影响较大，采用超声提取时，芍药苷的提取率最高。

2.5.2正交试验

2.5.2.1试验设计单因素试验结果表明甲醇浓度、物料比、超声时间、超声温度均对提取效果有影响，因此采用L9（34）重复正交试验设计考察四个因素不同水平对样品芍药苷含量测定值的影响，进而对其样品制备工艺进行优化，因素水平表见表1，正交试验安排及结果见表2，方差分析见表3。

直观分析结果表明各因素对指标的影响依次为A＞B＞D＞C，优选水平组合为为A1B1C3D1；方差分析结果表明A、B因素对指标变化的影响比较差异有统计学意义（P＜0.05），而C、D因素对结果影响比较差异无统计学意义（P＞0.05），因此初步确定优选条件为A1B1C1D1，并进行验证试验。

表1　因素水平表

表2　L9（34）重复正交试验结果（n=27）

表3　方差分析表

2.5.2.2验证试验取同批次的复方芍红颗粒，按照筛选出的最优供试品制备方法平行制备3份供试品，测定芍药苷含量。芍药苷含量结果平均值为（18.870± 0.127）mg/g，RSD=0.67%，提示该样品处理工艺稳定、合理、可行。

2.5.2.3确定样品处理工艺结合以上试验数据，确定样品前处理条件为取复方芍红颗粒约0.2 g，精密称定，置10 m L容量瓶中，精密加入70%甲醇，定容，功率100 W，温度40℃，超声10 min，放冷，用0.22μm微孔滤膜虑过，取续滤液作为供试品溶液。

2.6精密度试验

取3个浓度芍药苷对照品溶液，同一天连续进样6次，连续测定3 d，记录芍药苷峰面积，计算RSD。评价日内精密度与日间精密度。日内精密度RSD分别为1.50%、1.14%、0.48%；日间精密度RSD分别为1.35%、0.87%、0.82%；各峰的相对面积的RSD均小于2%，表明日内、日间仪器精密度良好。

2.7重复性试验

精密称取0.2 g复方芍红颗粒6份，按照供试品制备方法制备6份供试品，按前述色谱条件进样，测定芍药苷峰面积，计算芍药苷含量，计算RSD。6份供试品溶液含量的RSD为1.46%，表明本法重现性良好。

2.8稳定性试验

取同一供试品溶液，按前述色谱条件在0、2、4、8、12、24 h进样，测定芍药苷峰面积，计算芍药苷含量，计算RSD，供试品溶液在24 h内的RSD为1.49%，表明供试溶液在24 h内稳定。

2.9加样回收率

取已知含量复方芍红颗粒0.2 g 9份，分别加入对照品适量，按照供试品制备方法制备，按照前述色谱条件下进样，测定峰面积，计算芍药苷含量及回收率。测定峰面积见表4，回收率在98%～102%之间，RSD＜2%。结果表明，采用本法准确可靠，回收率良好。

表4　加样回收率试验结果（n=9）

2.10样品含量测定

取10批复方芍红颗粒，按照供试品制备方法制备，按照前述色谱条件下进样，测定峰面积，计算芍药苷含量，10批复方芍红颗粒中芍药苷含量分别为18.47、16.68、18.06、16.41、15.48、18.44、17.91、17.96、18.01、17.98mg/g，平均值为17.54mg/g。

3　讨论

3.1色谱条件的选择

在流动相的选择上，本实验先后选用乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸，乙腈-0.05%磷酸和甲醇-水为流动相进行分离，比较之后发现甲醇-水较其他体系，有机相用量少，柱压低，色谱峰较尖锐，分离效果好。塔板数较高，大于3000，分离度和拖尾因子基本符合要求［20-27］。

3.2供试品制备工艺的筛选

对供试品的制备工艺进行筛选，静置，超声和回流，结果显示超声较好，对溶剂浓度（10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、纯甲醇）进行筛选，最后得出甲醇浓度越高，对芍药苷提取得越完全，对超声时间（10、20、30、40、50 min）进行筛选，数据结果显示20min较好，对超声温度（20、30、40、50、60℃）进行筛选，数据结果显示50℃提取的芍药苷较完全。将单因素筛选出的条件，选取左右各两个因素进入正交试验，正交结果优选出70%甲醇，物料比1∶50，超声温度40℃，超声10 min，经过验证，该方法可尽可能提取出样品中的芍药苷。

3.3供试品溶液的含量测定

从10批供试品的测定结果来看，含量变化幅度不大，最高为18.47 mg/g，最低为15.48 mg/g，考虑到药材的来源，以及提取工艺、颗粒的制备，以及供试品溶液的制备等因素，将供试品中的芍药苷含量定为每克不低于15mg。

综上所述，本方法简单、快速、精密度高、重复性好，可以用于复方芍红颗粒中芍药苷的质量控制。

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Contents determ ination of paeoniflorin in Fufangshaohong Granules by RP-HPLC

GANWei1CHEN Jinfeng2MA Guizhi3▲
1.Pharmacy Department，Shandong Electric PowerCentralHospital，Shandong Province，Ji＇nan 250011，China；2.Pharmacy Division，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Xinjiang Autonomous Region，Urumqi 830011，China；3.College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Xinjiang Autonomous Region，Urumqi 830054，China

Ob jective To establish an RP-HPLCmethod for the determination of the content of paeoniflorin in the Fufangshaohong Granules.Methods The chromatographic columns（Kromasil C18，4.6 mm×250 mm，5μm）was applied to test the contentof paeoniflorin.Amixture ofmethanol-water（40∶60）was utilized as themobile phase whose flow rate was 1.0 mL/min.The detection wavelength was 232 nm，and the column temperature was set at 30℃.Results The results showed there were linear relationships between peak area and concentration of paeoniflorin within 0.008-0.512 mg/mL（r=0.9998）；The average recovery ratewas 100.31%，with a RSD value of 1.38%.The error of RSD in precision，stability and repeatability test were nomore than 2%；the average content of paeoniflorin was 17.54 mg/g.Conclusion The method in this paper is simple，quick，accurate and reproducible，which can be used for controlling the content of paeoniflorin in Fufangshaohong Granules.

Fufangshaohong Granule；Content determination；RP-HPLC；Paeoniflorin

R927.2

A

1673-7210（2016）06（c）-0138-04

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（2016-02-12本文编辑：赵鲁枫）