微生物菌剂对稻秆-猪粪-蘑菇渣堆肥腐熟进程及品质的影响

孙 旭，郝玉敏，苏良湖，赵志强，张龙江，戴传超，黄春艳，蔡金傍*

(1.环境保护部南京环境科学研究所，江苏南京 210042；2.南京师范大学生命科学学院，江苏南京 210046)

微生物菌剂对稻秆-猪粪-蘑菇渣堆肥腐熟进程及品质的影响

孙 旭1，郝玉敏2，苏良湖1，赵志强1，张龙江1，戴传超2，黄春艳2，蔡金傍1*

(1.环境保护部南京环境科学研究所，江苏南京 210042；2.南京师范大学生命科学学院，江苏南京 210046)

[目的]研究微生物菌剂对农业废弃物堆肥品质的影响。[方法]以稻秆、猪粪和蘑菇渣为主要原料进行好氧高温堆肥，通过测定堆肥过程中温度、pH、有机质、纤维素、木质素、种子发芽指数(GI)、微生物数量以及养分含量相关指标，研究了接种绿色木霉、黑曲霉、枯草芽孢杆菌(TAB处理)和拟茎点霉B3、绿色木霉、黑曲霉、枯草芽孢杆菌(PTAB处理)对稻秆-猪粪-蘑菇渣堆肥腐熟进程及产品品质的影响。[结果]自然堆肥过程中堆体最高温度为53 ℃，高温分解时间仅4 d，GI最高为93.00%，有机质最高降低了32.85%。TAB和PTAB处理在第2天后进入高温分解期，持续时间分别为5和7 d，最高温度分别达到59、65 ℃。堆肥结束时，TAB和PTAB处理的GI分别比对照处理增加了3和13个百分点，有机质含量分别降低了8.73%和23.58%。TAB和PTAB处理能显著提高堆肥产品中速效氮、速效磷、速效钾含量，提升堆肥产品品质。[结论]综合比较堆肥腐熟效果和产品品质，PTAB处理对稻秆猪粪的腐熟效果好于TAB处理。

微生物菌剂；堆肥进程；堆肥品质；稻秆；猪粪

我国农业废弃物种类繁多且数量巨大，其中农作物秸秆和畜禽粪便年产量分别在7亿和30亿t左右，是综合利用价值较高的可再生资源[1]。但目前我国农业废弃物利用方式相对粗放，农业秸秆除直接还田及用作燃料、饲料外，每年约2亿t秸秆未经处理在田间堆放或焚烧，造成巨大的资源浪费和环境污染[2]。高附加值的农业废弃物肥料化利用是农业废弃物减量化和资源化最为经济有效方式之一，由于秸秆含有大量的木质素、纤维素和半纤维素等难降解成分，导致自然堆肥腐熟时间长、产品质量差，不利于农业废弃物的高效利用[3-4]。研究表明，接种外源功能微生物可有效促进木质素等物质的降解，加快堆肥腐熟进程，增加发酵物肥力，提高生物有机肥的附加值；微生物组成的复合菌剂，对堆肥的适应性及腐熟效果强于单一菌种[5-7]。因此，研制具有高效腐熟能力的复合微生物菌剂对农业废弃物资源化利用有着重要的现实意义。

绿色木霉(Trichodermaviride)、黑曲霉(Aspergillusniger)及枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)都是生防菌，常常被作为堆肥腐熟菌剂使用。生长在植物内部的内生真菌对植物的侵染过程也是水解木质素和纤维素的过程。研究表明，部分内生真菌可降解纤维素并产生油脂，对植物凋落物具有较强的降解能力[8]。陈晏等从重阳木中分离出1株植物内生真菌拟茎点霉B3(Phomopsisliquidambari)，该B3菌可离开宿主存活于土壤中，能分泌漆酶，促进土壤纤维素酶活性，加快茅苍术凋落物和花生秸秆的降解[9-11]。郝玉敏等研究发现，拟茎点霉B3、绿色木霉、黑曲霉及枯草芽孢杆菌复合菌剂与有机肥配施能改善土壤微生物区系，提高土壤酶活性[12]。然而，这些生防菌作为堆肥腐熟接种菌剂能否促进堆肥腐熟化进程尚不清楚。笔者以稻秆、猪粪和蘑菇渣为堆肥原料，以拟茎点霉B3、绿色木霉、黑曲霉及枯草芽孢杆菌为外源接种菌剂，研究了不同微生物菌剂对稻秆-猪粪-蘑菇渣堆肥腐熟进程及品质的影响，以期为农业废弃物资源化利用提供科学依据。

1　材料与方法

1.1试验材料试验所用水稻秸秆为江苏省农业科学院提供的长度为1～2 cm的干碎料，猪粪为采自江苏省镇江市三明生物有限责任公司的新鲜猪粪，蘑菇渣为江苏省常州市阿波罗生物工程有限公司提供的金针菇发酵物。3种物料的基本特性见表1。植物内生拟茎点霉属菌株B3分离自重阳木，绿色木霉、黑曲霉及枯草芽孢杆菌等菌种均购自广东省微生物菌种保藏中心。

表1　试验物料的基本性质

1.2稻秆猪粪腐熟试验

1.2.1微生物菌剂制备。真菌用马铃薯葡萄糖液体培养基培养，细菌用牛肉膏蛋白胨液体培养基培养。以10%接种量接入固体培养基中，固体发酵培养基质为麸皮、糠和稻壳混合物(质量比6∶3∶1，料水比为1∶1.2)。搅拌均匀后于28 ℃静置培养7 d，真菌有效活菌数达到104CFU/g左右，细菌有效活菌数达到108CFU/g。

1.2.2堆肥试验。于2011年12月13日到2012年1月14日在温室大棚进行。采用9个口径27 cm、高20 cm的花盆进行试验，每个花盆内含稻秸500 g、猪粪300 g、蘑菇渣300 g、接种物150 g，混匀后C/N约为28，每个花盆外裹稻草保温。设3个处理，分别为对照(CK)，施加150 g灭菌固体培养基；TAB处理，施加绿色木霉、黑曲霉、枯草芽孢杆菌3种菌的固体发酵菌剂150 g(1∶1∶1)；PTAB处理，施加拟茎点霉B3、绿色木霉、黑曲霉、枯草芽孢杆菌4种菌的固体发酵菌剂150 g(1∶1∶1∶1)。每处理3次重复。加入一定量的自来水，调节含水率为70%左右，进行好氧高温发酵，堆肥时间为32 d，堆肥前16 d每隔2 d记录堆肥温度，16 d后每隔4 d测定堆肥温度。从堆肥当天开始每8 d从堆体取样100 g左右，一部分样品用自封袋密封，保存于4 ℃冰箱中，用于pH、种子发芽率和微生物数量的测定；另一部分样品于105 ℃烘干粉碎过0.8 mm筛，用于有机质、营养成分、木质素、纤维素的测定。

1.3测定项目与方法

1.3.1pH的测定。称取2 g左右的鲜样，按照样水比1∶10稀释后，120 r/min振荡1 h，过滤，取上清液于小烧杯中，用pH计测定pH。

1.3.2种子发芽指数(GI)的测定[13]。称取 5.00 g 鲜样放于三角瓶中，加入50 mL蒸馏水，充分振荡，30 ℃浸提24 h，过滤，取6 mL滤液到铺滤纸的培养皿中，取10粒水堇种子置于其中，室温下放置48 h。3次重复。同时以蒸馏水为CK，测定发芽率。

1.3.3其他。有机质含量采用重铬酸钾氧化法测定；微生物数量采用平板稀释法测定[14]；全氮、全磷、全钾、速效氮、速效磷、速效钾含量参考[15]中的方法测定；木质素含量采用浓硫酸法测定；纤维素含量采用改进的浓酸水解定糖法测定[16]。

1.4数据统计试验结果以算术平均数±标准误表示，采用SPSS 18.0 软件进行数据方差分析。

2　结果与分析

2.1微生物菌剂对堆肥温度的影响堆肥过程中温度的变化可以反映堆肥腐熟进程。从图1可以看出，整个堆肥过程中，各处理堆体温度变化均呈先上升后下降的趋势，接种微生物菌剂能加快堆肥发酵速度，缩短堆肥发酵时间。CK第4天进入高温分解期(>50 ℃)，高温分解时间仅维持4 d，整个堆肥过程中最高温度为53 ℃。TAB和PTAB处理在第2天后进入高温分解期，持续时间分别为5和7 d，最高温度分别达到59和65 ℃。堆体温度在50 ℃以上保持5～7 d，是保证堆肥达到卫生学指标和腐熟的必要条件，添加微生物菌剂的堆肥菌满足堆肥卫生指标的要求，其中PTAB菌剂的效果好于TAB菌剂。

图1　堆肥过程中温度的变化Fig.1　The change of temperature during composition

2.2微生物菌剂对堆肥pH的影响从图2可以看出，堆肥过程中pH呈先上升后下降的趋势。堆肥开始时各处理pH为7.7～7.9，随着堆肥的进行，堆体中易分解的蛋白质类物质经微生物分解后产生氨基酸，进一步脱氨产生NH3，使pH升高。在第8天pH达到最大值(8.3～8.4)，而后氨氮挥发及有机物矿化分解产生有机酸，使pH降低，在堆肥结束时各处理堆肥pH为7.8～8.0，随着降解过程的进行，PTAB和TAB处理的pH高于CK。

图2　堆肥过程中pH的变化Fig.2　The change of pH during composition

2.3微生物菌剂对堆肥中有机质含量的影响从图3可以看出，随着堆肥时间的延长，各处理堆肥中有机质含量均呈下降趋势，PTAB和TAB处理的有机质含量下降幅度较CK大。CK的有机质含量在第16天为445.7 g/kg，比开始时降低了31.10%，到第32天有机质含量为434.3 g/kg，下降了约32.85%。第16天PTAB和TAB处理的有机质含量分别为388.8 g/kg(P<0.05)和358.4 g/kg(P<0.01)，比CK降低了12.76%和19.59%；第32天PTAB和TAB处理的有机质含量分别降低到396.4 g/kg(P<0.01)和331.9 g/kg(P<0.01)，比CK降低了8.73%和23.58%。这表明接种外源功能微生物可以促进稻秆猪粪堆肥有机物质的降解，其中PTAB菌剂对堆肥中有机质的分解效果好于TAB菌剂。

图3　堆肥过程中有机质含量的变化Fig.3　The content of organic matter during composition

2.4微生物菌剂对堆肥中纤维素和木质素含量的影响

2.4.1纤维素含量。从图4可以看出，随着堆肥的进行堆料中纤维素含量呈降低趋势，其中PTAB和TAB处理的纤维素含量下降幅度较CK大。堆肥结束时，CK中纤维素含量为18.75%，降解了44.90%，而PTAB和TAB处理的纤维素含量分别为17.71%和15.97%，比CK降低了5.55%和14.83%。这表明接种外源微生物菌剂有利于纤维素的降解，PTAB菌剂对堆肥中纤维素的降解效果好于TAB菌剂。

图4　堆肥过程中纤维素含量的变化Fig.4　The change of cellulose content during composition

图5　堆肥过程中木质素含量的变化Fig.5　The change of ligin content during composition

2.4.2木质素含量。从图5可以看出，水稻秸秆腐熟过程中木质素的降解较为缓慢，各处理堆肥木质素含量呈下降趋势，PTAB和TAB处理的纤维素含量下降幅度较CK大。经32 d的腐熟，CK的木质素含量从开始的24.83%降至16.15%(P<0.01)，降解了34.96%；堆肥结束时，TAB和PTAB处理的木质素分别为14.93%和13.54%，比CK降低了7.54%和16.16%。这表明接种外源微生物能加速水稻秸秆木质素降解，PTAB菌剂对堆肥中木质素的降解效果好于TAB菌剂。2.5添加微生物菌剂的稻秸-猪粪-蘑菇渣堆肥对种子发芽指数的影响GI常被用来测定堆肥的生物毒性，是表征堆肥腐熟水平的重要生物学指标之一。一般认为，当GI大于50%时，可认为堆肥发酵物对作物基本无毒性，堆料基本腐熟；当GI大于80%时，堆料无植物毒性且已腐熟[13，17]。从图6可以看出，不同处理的堆肥发酵物GI呈先下降后上升的趋势。堆肥开始时有机质未分解，对植物抑制作用小，由于接种菌剂后加快了有机质的降解，产生了较多的有毒物质(氨和低级脂肪酸等)，抑制了水堇种子的发芽，第8天PTAB和TAB处理的GI均为67.00%，低于CK(70.00%)。随着堆肥的进行，有毒物质减少，第16天时PTAB的GI达到80.00%，较CK和TAB处理高出7.00和3.00个百分点，堆肥结束时各处理堆肥GI为80.00%～93.00%。这表明接种外源微生物菌剂有助于降低堆肥发酵物植物毒性，加快堆肥腐熟进程。

图6　添加微生物菌剂的稻秸-猪粪-蘑菇渣堆肥对种子发芽指数的影响Fig.6　The effect of composting by adding microbial agents rice straw-pig manure-mushroom residue on seed germination index

2.6微生物菌剂对堆肥中微生物数量的影响

2.6.1细菌数量。细菌是堆肥腐熟过程中数量最多的微生物，可快速分解糖类、淀粉和蛋白质类易降解物质，部分细菌也参与纤维素的分解，进行自身生长代谢和产生热量[18]。从图7可以看出，随着发酵时间的延长，不同处理堆料中细菌数量呈先上升后下降的趋势。堆肥开始时，堆料中易降解物质较多，细菌迅速繁殖，CK、TAB和PTAB处理的细菌数量分别从2.6×109、3.6×109和5.4×109CFU/g增加到第8天的4.7×109、5.7×109和6.9×109CFU/g。随着堆肥的进行，由于高温及营养物质的消耗，大多数细菌死亡，细菌数量降低，堆肥结束时各处理堆体细菌数量分别为2.3×109、2.5×109和2.5×109CFU/g，并无显著性差异。这表明接种外源功能微生物菌剂能增加堆肥初期细菌的数量，促进有机质的降解。

图7　堆肥过程中细菌数量的变化Fig.7　The change of bacteria number during composting process

2.6.2放线菌数量。从图8可以看出，堆肥过程中放线菌数量低于细菌数量，呈先上升后下降的趋势。在堆肥前期放线菌数量逐渐升高，TAB和PTAB处理的放线菌数量在第8天分别达到最大值34.3×107和38.0×107CFU/g，显著高于CK(26.7×107CFU/g)；随着堆肥进行，各处理堆肥中放线菌数量持续下降，到堆肥结束时放线菌数量无显著性差异。

2.6.3真菌数量。从图9可以看出，堆肥腐熟过程中真菌数量的变化趋势与细菌相似，但数量低于细菌。在堆肥前期真菌数量持续升高，TAB和PTAB处理的真菌数量在第8天达到最大值，分别为17.8×108和26.7×108CFU/g，显著高于CK(14.7×108CFU/g)；堆肥结束时，TAB和PTAB处理的真菌数量分别达到4.4×108和4.0×108CFU/g，均高于CK(2.2×108CFU/g)，且各处理堆肥真菌数量与起始的真菌数量并无显著性差异。

2.7微生物菌剂对堆肥中养分含量的影响堆肥过程是一个复杂的生物化学过程，伴随着有机物的降解及氮、磷、钾的释放和固定，氮、磷、钾的含量直接影响最终堆肥产品质量[15]。从图10可以看出，随着堆肥的进行，各处理物料中的养分含量均呈持续上升趋势。与PTAB处理相比，TAB处理的全氮和速效氮含量较高，速效磷和速效钾含量较低。

图8　堆肥过程中放线菌数量的变化Fig.8　The number of actinomycetes during composting process

图9　堆肥过程中真菌数量的变化Fig.9　The number of fungi during composting process

图10　堆肥过程中养分含量的变化Fig.10　The nutrient contents of composting product

3　讨论

堆肥是在微生物的作用下将复杂的有机物分解为细胞可利用的小分子物质，并形成稳定腐殖质的过程。自然堆肥腐熟时间长、产品质量差，不利于农业废弃物的高效利用。大量研究表明，在自然堆肥初期接种微生物菌剂能增加堆肥初期微生物数量，提高微生物代谢活性，加快有机物的降解，促进堆料的腐熟。Maeda等[18]研究表明，在堆肥初期接种芽孢杆菌和链霉菌，可在堆肥过程中增加细菌数量，加速有机质分解；接种EM菌剂有利于堆肥矿化作用，缩短堆肥腐熟时间5～8 d[15]。也有学者认为，接种的外源微生物在与土著微生物竞争过程中处于劣势地位，难以形成优势菌，因此，没有必要接种微生物菌剂[19]。笔者在堆肥初期接种不同微生物菌剂进行稻秆-猪粪-蘑菇渣好氧高温堆肥，结果表明：接种微生物菌剂能增加堆肥过程中细菌、真菌和放线菌数量，形成优势种群，缩短堆肥时间，加速有机质、木质素、纤维素的降解，提高种子发芽指数，加快稻秆猪粪堆肥腐熟进程。

堆肥过程中有机物的降解主要是在细菌、真菌、放线菌的协同作用下完成，这些微生物存在较明显的群落结构演替，不同腐熟阶段出现对特定有机物质起分解作用的微生物群体[3]。Muktadirul等研究表明，具有协同关系的微生物组成的复合菌剂可相互利用反应产物，形成较为稳定的微环境，对堆肥的适应性及腐熟效果都要强于单一菌种[20-22]。笔者以水稻秸秆、猪粪和蘑菇渣为主要堆肥原料，其中纤维素和木质素含量分别为32.9%和23.9%，这类物质不易降解，因此选择对纤维素作用较强的绿色木霉、黑曲霉、枯草芽孢杆菌作为堆肥初期的接种微生物[23]。拟茎点霉B3是从重阳木中分离得到的一株植物内生真菌，能与大多数微生物形成互利共生关系[9]。该B3菌能分泌降解木质素的关键酶——漆酶，粗酶液经50 ℃处理1 h后，仍能保持83.11%的活性，且在pH 6.0～8.0时，酶活较为稳定，可促进堆肥过程中木质素和纤维素的分解[11，24]。笔者研究发现，接种拟茎点霉B3、绿色木霉、黑曲霉、枯草芽孢杆菌4种复合菌剂对堆肥腐熟效果好于绿色木霉、黑曲霉、枯草芽孢杆菌3种复合菌剂。

堆肥过程中有机物被不断分解，同时由于含水率的降低，堆体中无机营养成分会产生“浓缩效应”，使养分相对含量增加。笔者研究发现，接种外源微生物能促进有机质的分解，加剧“浓缩效应”，从而显著提高堆肥产品中养分含量，这与前人研究结果一致[15]。PTAB菌剂堆肥全氮和速效氮含量均显著低于TAB菌剂堆肥的含量，这可能与堆料的pH有关。堆肥过程中PTAB菌剂堆肥的pH高于TAB菌剂堆肥，pH越高NH3越易挥发，反硝化细菌活性越强，氮损失也越多，全氮含量越低，越不利于氨氧化菌和硝化细菌的生长，铵态氮转化为亚硝态氮和硝态氮量减少，速效氮含量降低[25-26]。

4　结论

(1)在稻秆-猪粪-蘑菇渣好氧堆肥初期接种外源微生物菌剂能增加微生物的数量，加速有机质、纤维素、木质素的降解，缩短堆肥腐熟时间，延长高温分解时间，提高种子发芽指数，促进堆肥腐熟进程，PTAB菌剂的腐熟效果好于TAB菌剂。

(2)接种外源微生物能显著提高堆肥产品养分含量，提升堆肥品质，其中PTAB菌剂堆肥产品中全磷、全钾、速效磷、速效钾含量最高，TAB菌剂堆肥产品中全氮和速效氮含量最高。

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Effect of Microbial Agents on Composting Process and Product Quality of Rice Straw-Pig Manure-Mushroom Residue

SUN Xu1, HAO Yu-min2, SU Liang-hu1, CAI Jin-bang1*et al

(1.Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Nanjing,Jiangsu 210042;2.College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing,Jiangsu 210046)

[Objective]The aim was to study effects of microbial agents on compost product quality of agricultural wastes. [Method] A compost test was conducted by usingrice straw-pig manure-mushroom residue as main materials to study the effects ofTrichodermaviride,Aspergillusniger,Bacillussubtilis(TAB) andPhomopsisasparagiB3,Trichodermaviride,Aspergillusniger,Bacillussubtilis(PTAB) on composting process and quality through determining the changes of temperature, pH, organic matter, cellulose and lignin, seed germination rate, number of microbial, nutrient content in the composting process. [Result] In the control treatment the highest temperature was 53 ℃, and the high temperature sustaining time was only 4 days, the highest GI was 93.00% and the highest organic matter decreased by 32.85%. In the composting treatment with microbial agents TAB and PTAB the time of reaching high temperature were 2 days and the high temperature sustaining time were respectively 5 and 7 days, while the highest temperature were 59℃ and 65℃, respectively. At the end of composting, the GI of the composting treatment with microbial agents TAB and PTAB increased by 3.0% and 13.0%, while the content of organic matter were decreased by 8.73% and 23.58%. At the maturity, it was found that the composting treatments with microbial agents TAB and PTAB, had higher contents of available,-N, -P, -K than the control treatment, significantly improved the compost product quality. [Conclusion] In the view of composting maturity and quality, the accelerating effect of PTAB on rice straw and pig manure compost was better than TAB.

Microbial agents; Compost process; Compost quality; Rice straw; Pig manure

“十二五”国家科技支撑计划(2014BAL02B04-02)。

孙旭(1986- )，男，湖北襄阳人，助理研究员，博士，从事农业废弃物资源化技术研究。*通讯作者，副研究员，博士，从事农村环境污染防治研究。

2016-08-10

S 141.4

A

0517-6611(2016)27-0167-05