黄芩苷对牙周炎大鼠牙龈组织及外周血中IL-1β表达的影响

李会英　李国兴　崔佳　刘哲敏　杜宁　刘学聪　乔玉巧



·论著·

黄芩苷对牙周炎大鼠牙龈组织及外周血中IL-1β表达的影响

李会英李国兴崔佳刘哲敏杜宁刘学聪乔玉巧

目的采用大肠杆菌脂多糖诱导大鼠牙周炎模型，观察黄芩苷对牙周炎大鼠牙龈组织及外周血中白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)表达水平的影响。方法选用50只8周龄SD大鼠，随机分成5组，每组10只，A组为对照组，B组为牙周炎组，C1、C2、C3组为黄芩苷治疗组，治疗1周后处死大鼠采取其外周血及牙龈组织，采用微量样本多重蛋白定量技术(CBA)检测外周血中IL-1β含量，采用RT-PCR法检测大鼠牙龈组织中IL-1βmRNA的表达水平。结果B组大鼠牙龈组织中IL-1βmRNA及外周血中IL-1β表达含量均明显高于A组(P<0.05)，C1、C2、C3组大鼠牙龈组织中IL-1βmRNA和外周血中IL-1β表达含量均明显低于B组(P<0.05)。结论黄芩苷可以降低牙周炎大鼠牙龈组织中IL-1βmRNA和外周血中IL-1β表达水平，抑制脂多糖对大鼠牙周组织的损伤作用。

黄芩苷；牙周炎； 白介素-1β；大鼠

牙周炎的主要致病菌为革兰阴性厌氧菌，其细胞壁中的主要毒性成分脂多糖(LPS)可抑制牙周组织细胞的生长和繁殖，又可激活宿主防御细胞释放多种炎性细胞因子(如 TNF-α、IL-1β和 IL-6等)介导炎性反应，导致牙周组织的损伤。黄芩是我国传统中药，其有效成分黄芩苷具有抑菌、清热、抗炎、抗变态反应等药理活性，可以显著增加和促进牙龈成纤维细胞的增殖活性和胶原蛋白的合成[1]。本实验通过局部应用黄芩苷治疗大鼠牙周炎，采用RT-PCR法检测大鼠牙龈组织IL-1βmRNA表达含量，采用微量样本多重蛋白定量技术(CBA)检测大鼠外周血中 IL-1β表达含量，观察其变化状况，探讨黄芩苷治疗牙周炎的作用。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物：SD大鼠50只，清洁级，8周龄，雄性，体重(220±20)g，由河北医科大学实验动物中心提供(动物合格证号：1410084)。大鼠适应环境1周后进行实验。喂饲实验动物中心的标准动物饲料，自由摄取水和食物。

1.1.2主要药品与仪器：大肠杆菌ATCC O55:B5的脂多糖 (美国，sigma公司)，黄芩苷(中国药物生物制品检定所)大鼠IL-1β检测试剂盒(美国BD公司)。总RNA提取试剂TRIzol Reagent(GIBCOBRL公司,美国)；逆转录试剂与PCR试剂SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (TaKaRa公司，日本)；IL-1β及GADPH引物(上海生工生物工程有限公司)；Kodak_1DDC_120电泳凝胶成像自动分析系统(Kodak公司,美国)；7500荧光定量PCR仪(AB公司；美国)；流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2实验方法

1.2.1溶液的配制：取2 mg黄芩苷溶于2 ml 0.9%氯化钠溶液中，碳酸氢钠调pH值至7.4，至黄芩苷完全溶解，成为1 mg/ml的储存液，4℃保存备用，试验时用0.9%氯化钠溶液稀释至所需浓度；取10 mg脂多糖(LPS)，用0.9%氯化钠溶液稀释至1 mg/ml的溶液。LPS的终末浓度为1 mg/ml，黄芩苷终末浓度为0.01、0.1、1.0 μg/ml。

1.2.2动物分组及牙周炎模型的建立：取SD大鼠50只，随机分5组：对照组(A组)、牙周炎组 (B组)、黄芩苷治疗组(C1、C2、C3组)，每组10只。除A组外，其余4组大鼠用10%水合氯醛(0.3 g/kg)腹腔注射麻醉成功后，选大鼠右上颌第1、2磨牙之间颊腭侧龈沟底注射LPS(1 mg/ml)各0.2 ml，每天在同一部位重复1次，连续3 d，1周后大鼠牙周炎模型建立。

1.2.3黄芩苷的局部治疗：大鼠牙周炎模型建立后第2天开始用药，A组不用药，黄芩苷治疗组(C1、C2、C3组)每天在大鼠右上颌第1、2磨牙之间颊腭侧龈沟底分别注射0.01、0.1、1.0 μg/ml黄芩苷溶液各0.2 ml，B组注射等量0.9%氯化钠溶液，均连续3 d，分笼饲养。用药前、后分别观察5组大鼠牙周组织、全身状况、毛发、食欲及粪便情况。

1.2.4动物处死及标本采集：用药后第7天，10%水合氯醛腹腔注射麻醉成功后，于腹主动脉取血5 ml，3 500 r/min离心，取上清液，-70℃冰箱保存，用于外周血IL-1β的检测；取颈椎脱臼法处死5组大鼠，5 min 内取其右上颌第1、2磨牙颊腭侧实验处新鲜牙龈组织放置于eppendorf管中，液氮骤冷后，-70℃冰箱保存，用于牙龈组织IL-1βmRNA的检测；剪取其右上颌、牙、牙槽骨及牙周组织，0.9%氯化钠溶液冲洗后置于10%甲醛固定、10%EDTA脱钙、包埋，制作右上颌磨牙颊腭向石蜡切片，片厚5 μm，苏木精-伊红染色，于光学显微镜下观察牙槽骨吸收及牙周袋形成情况。

1.2.5RT_PCR检测大鼠牙龈组织中IL-1β mRNA的表达水平：①提取RNA 将牙龈标本复融，取0.1 g粉碎至匀浆状，加入1 ml RNA裂解液吹打均匀，加入200 μl氯仿混匀，13 000 r/min 4℃离心15 min。取上清加入500 μl异戊醇，-30℃放置12 h，离心同上。弃上清，加75%乙醇200 μl洗涤，再次离心同上，弃上清得白色沉淀，加入50 μl聚碳酸二乙酯(diethlpyrocarbonate，DEPC)，置-20℃冰箱备用。采用紫外分光光度计测定RNA纯度。②逆转录合成cDNA 取1 μl IL-1β RNA，2×缓冲液(buffer)5 μl，2 mmol/L MgSO42 μl，10 mmol/L脱氧核苷三磷酸(dNTPs )0.5 μl，40 U/μl RNA酶抑制剂(RNase Inhibitor)0.25 μl，逆转录酶(Bca_Best polymerase)0.5 μl，寡脱氧胸苷酸(OligodT)0.5 μl，以双蒸水补足反应体积至10 μl，操作严格按试剂盒说明书进行。③PCR扩增 PCR反应体系为20 μl，其中包括SYBR Premix Ex TaqTM(2×)10 μl，Rox Reference DyeⅡ(50×)0.4 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl，cDNA模板2 μl及dH2O 6.8 μl。置于7500 real-time PCR仪上，两步法PCR扩增，扩增程序为：第1步预变性：95℃ 30 s；第2步 PCR反应：95℃ 5 s，60℃ 1 min，40个循环。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳验证。以 GAPDH 作为内参照。引物序列见表1。

表1　基因引物的碱基序列

1.2.6流式液相多重蛋白定量技术(CBA)检测外周血中IL-1β的含量：将已分离的血清上清液标本从冰箱取出置于室温下，待溶解后采用CBA技术通过流式细胞仪(美国BD公司)检测血浆中IL-1β的含量，具体按试剂盒说明书操作。

2　结果

2.1实验动物一般情况A组大鼠牙龈组织无充血肿胀，无牙周袋，神态、活动正常，毛泽光亮，饮食、饮水、大便正常，体重逐渐增加。B组大鼠于第 3 次注射LPS后出现牙龈组织充血肿胀，触之易出血，牙周袋形成，探诊深度4～5 mm，神态倦怠、活动笨拙、皮毛无光泽、进食水减少、大便干燥，体重增加不明显，B组注射0.9%氯化钠溶液后牙龈仍然红肿，牙周袋深度4～5 mm，神态倦怠、活动笨拙、皮毛无光泽、进食水减少、大便干燥等症状无明显改善，而C1、C2、C3组随着注射黄芩苷后，上述症状逐渐改善，牙龈组织充血减轻，牙周袋变浅，神态趋于正常，皮毛光泽改善，进食、活动增多，体重逐渐增加，并且C3组效果最明显。

2.2牙龈组织病理变化A组牙龈上皮和上皮下结缔组织无病理性改变，牙周膜纤维排列整齐，牙槽骨表面光滑，无明显骨吸收、破骨细胞和骨吸收陷窝形成。B组牙间乳头沟内上皮溃疡、坏死、牙周袋形成，牙周膜炎性细胞浸润明显，纤维排列紊乱，牙槽嵴表面呈蚕食状，吸收明显，牙槽骨内骨质疏松，破骨细胞和骨吸收陷窝明显可见。黄芩苷治疗组(C1、C2、C3组)牙周组织表现较牙周炎组好转，炎性细胞逐渐减少，成纤维性细胞逐渐增多，牙周间隙逐渐正常，牙周膜及牙槽骨结构比较正常，牙周膜主纤维束排列较整齐，固有层血管扩张及淋巴细胞渗出逐渐减轻，破骨细胞浸润减少。见图1。

A组B组C1组C2组C3组

图15组牙周组织形态 (HE ×10)

2.3黄芩苷对大鼠牙龈组织IL-1βmRNA表达的影响B组大鼠牙龈组织中IL-1βmRNA表达水平(即相对含量)较A组明显升高(P<0.05)； C1、C2、C3组大鼠牙龈组织中IL-1βmRNA表达水平均较B组明显降低(P<0.05)，且C1、C2、C3组大鼠牙龈组织中IL-1βmRNA表达水平依次逐渐下降(P<0.05)。提示牙周炎组大鼠牙龈组织中IL-1βmRNA的表达强度明显高于正常对照组大鼠，用黄芩苷治疗1周后,黄芩苷治疗组大鼠牙龈组织IL-1βmRNA表达强度随黄芩苷浓度增加依次逐渐下降。见表2。

2.4外周血中IL-1β含量表达B组大鼠外周血中IL-1β含量明显高于A组(P<0.05)，而C1、C2、C3组IL-1β含量均较B组明显降低(P<0.05)，且C1、C2、C3组的IL-1β含量逐渐下降。提示牙周炎组大鼠外周血IL-1β含量明显增高，黄芩苷治疗1周后,各治疗组外周血中IL-1β含量随黄芩苷浓度增加依次明显下降。见表2。

　组别IL⁃1βmRNA(fold)IL⁃1β(pg/ml)A组27．45±9．221．00±0．00B组75．56±1．66∗1．54±0．07∗C1组64．43±2．11∗#1．40±0．08∗#C2组51．12±5．10∗#1．26±0．06∗#C3组39．67±4．95∗#1．13±0．04∗#F值38．4743．60P值4．82×10-62．69×10-6

注：与A组比较，*P<0.05;与B组比较，#P<0.05

3　讨论

牙周病是由革兰阴性(G-)细菌等引起一种以骨破坏为主要特征的慢性细菌感染性疾病，其中革兰阴性厌氧菌及内毒素刺激可引起宿主局部免疫细胞反应,从而激活宿主防御细胞释放TNF-α、IL-1和 IL-6等多种炎性细胞因子，这些炎性细胞因子继发引起牙龈组织炎症、牙槽骨破坏和吸收等牙周组织损伤[2，3]。内毒素是G-菌胞壁外膜中的LPS,是G-菌所独有的一种致病物质,对牙周组织具有很高的毒性。LPS的化学组成在不同微生物之间有所不同，但其基本结构相似。LPS的生物活性中心是类脂A，几乎可介导所有LPS的所有生物学反应,各种G-菌类脂A的化学成分和结构极其相似,是LPS结构中最保守的部分,无种属特异性,所以不同G-菌的LPS引起的毒性作用基本相似[4]。采用大肠杆菌LPS诱导的大鼠实验牙周炎模型,简便、可比性强，具有可重复性，已由SUNY Stony Brook动物用户委员会认可[3]。本实验采用大肠杆菌LPS进行实验，连续3 d在大鼠右上颌磨牙同一部位的牙龈组织中注射LPS,1周后牙周袋形成,牙龈红肿,探诊出血。光镜下显示，炎性细胞聚集,破骨细胞浸润,牙槽骨吸收。

IL-1是一种单核细胞因子，包括 IL-1α、IL-1β 及其受体拮抗剂等，可作用于机体的各个系统，具有广泛的生物学活性，参与免疫调节、介导炎性反应和影响组织代谢。IL-1β主要功能是致炎作用，其生物学效应与牙周组织的破坏作用直接相关，是介导牙周炎症的重要炎性细胞因子，可引起牙周结缔组织损伤及牙槽骨吸收[5]。有研究发现IL-1β引起牙周组织破坏可通过以下途径：IL-1β与TNF-α、前列腺E2(PGE2)协同作用引起骨吸收，抑制骨生成；IL-1β刺激牙龈成纤维细胞和牙周膜细胞产生基质金属蛋白酶；IL-1β抑制人牙周韧带成纤维细胞碱性磷酸酶基因的表达，影响组织恢复和骨性愈合；刺激纤溶酶原激活剂，导致纤溶酶增多，使基质金属蛋白酶的活性增强，引起牙周结缔组织降解、牙周附着丧失；刺激成骨细胞、牙周膜细胞产生PGE2、IL-6等骨吸收强诱导剂，增强骨吸收[6-9]。另有研究表明， IL-1β可通过调节骨保护素(OPG)和 核因子因子κB受体活化剂配体(RANKL)的变化，引起牙槽骨吸收[10]；IL-1β可刺激牙周膜成纤维细胞分泌肝细胞生长因子，引起上皮细胞增殖并向根方迁移、牙周袋形成及一系列牙周膜细胞的炎性反应和免疫应答[11]。

近年来许多学者认为，牙周炎症不仅存在于局部牙周组织，还与全身系统性免疫炎性反应有关，牙周炎可能引起机体外周血循环中IL-1β和TNF-α等致炎细胞因子的水平，参与多种全身疾病的发生和发展。孙晓军等[12]研究发现，牙周炎患者血清IL-1β浓度显著高于牙周健康者。IL-1β浓度升高的原因可能是致病微生物及其毒素通过感染、破溃的牙周袋上皮，刺激牙周组织，局部产生的高浓度的IL-1β进入血循环中，另一方面可能是细菌及其毒素的全身播散，引起血中白细胞和其他一些组织、细胞释放更多的IL-1β，导致血浆中IL-1β水平的升高。因此，在牙周炎的临床治疗中，抑制炎性细胞因子IL-1β的生成，，对牙周炎及全身疾病的治疗均有积极的治疗意义。

黄芩苷具有抑菌、清热、抗炎、抗变态反应等药理活性，能够抑制牙周组织的炎症反应，显著降低脂多糖诱导的单核细胞中IL-1β的合成，增加牙龈成纤维细胞的细胞活性、线粒体活性、胶原和总蛋白质的合成，对牙龈成纤维细胞有激活作用[13-15]；而且有研究发现黄芩苷对内毒素还有较好的直接降解作用，其降解作用具有时间和浓度依赖性，局部应用黄芩苷治疗牙周病还能有效改善临床及细菌学指标[2,16]。目前局部应用化学药物对牙周炎的疗效也比较明显，但这些药物仅能杀灭致病菌，却不能直接拮抗菌体溶解后产生的内毒素，并且化学药物存在毒副作用大、耐药性强等问题，应用受到局限。而黄芩苷既对内毒素有较好的降解作用，又可以抑制炎性因子的合成，促进牙周成纤维细胞的活性，黄芩又是我国传统中药，来源丰富、价格低廉、不良反应小，因此利用黄芩苷防治牙周病具有广阔的前景。

本实验结果显示，与牙周炎组相比，局部注射黄芩苷后，黄芩苷治疗组大鼠的一般情况与牙周炎组相比均有明显好转，各治疗组大鼠牙龈组织充血减轻，牙周袋变浅，神态趋于正常，皮毛光泽改善，进食、活动增多，体重逐渐增加；黄芩苷各治疗组牙龈组织中IL-1βmRNA和其外周血中IL-1β的表达含量均明显低于牙周炎组，随着黄芩苷浓度升高，IL-1β表达水平逐渐降低，表明黄芩苷可降低实验性牙周炎大鼠牙龈组织中IL-1βmRNA和其外周血中IL-1β的表达水平，抑制IL-1β的分泌和合成，减轻机体炎性反应，抑制牙槽骨吸收，提示临床上局部应用黄芩苷治疗牙周炎，可能会减轻牙周炎的炎性反应，抑制破骨细胞形成，促进牙周病患者的康复。

综上所述，黄芩苷可改善牙周炎大鼠的一般状况，降低牙周炎大鼠牙龈组织和外周血中IL-1β的表达水平，阻断脂多糖对大鼠牙周细胞内膜性结构的损伤，但具体作用机尚需进一步研究。

1Chung CP,Park JB,Bae KH,et al.Pharmacological effects of methanolic extract from the root of Scutellaria baicalensis and its flavonoids on human gingival fibroblast.Planta Med,1995,61:150-154.

2窦永青,李庆星,王瑶,等.黄芩苷局部应用治疗慢性牙周炎的疗效观察.实用口腔医学杂志,2006,22:728-729.

3Liavaneras M,Ramamurthy O,Heikkila N,et al.A combination of a chemically modified doxycycline and a bisphosphonate synergistically inhibits endotoxin-induced periodontal breakdown in rats.J Periodontol,2001,72:1069-1077.

4张凤秋,吴织芬,万玲.牙周优势菌内毒素的生物学活性及与牙周炎相关的发病机制.牙体牙髓牙周病学杂志,2003,13:166-169.

5杨丕山，赵民，戚向敏，等.外源性IL-10对炎症牙龈组织中IL-6和ICAM-1表达的影响. 华西口腔医学杂志，2002，20：343-345.

6Branco-de-almeida LS,Franco GC,Castrom L,et al.Fluoxetineinhibitsi nflammatoryresponseandbonelossinaratmodelofligature-inducedp eriodontitis.J Periodontal, 2012,83：664-671.

7Bage T，Kats A，Lopez BS，et al.Expressionofprostaglandinesynthasesi nperiodontitisimmunolocalizationandcellu-larregulation.Am J Pathol，2011，178：1676-1688.

8Ejeil AL，Gaultier F，Tehens I，et al.Arecytokinelinkedtocolla-g enbreakdownduringperiodontaldiseaseprogression.J Periodontol，2003，74：196-201.

9陈良娇. 白介素-1调节牙周膜细胞参与骨吸收的研究进展.广 东牙病防治，2010，18：103-105.

10张兰，孙林林，丁岩，等.LI-1β 对人牙周膜成纤维细胞OPG、 RANKLm RNA表达的影响.牙体牙髓牙周病学杂志，2012，22：440-444.

11段燕.TGF-β1对IL-1β诱导人牙周膜成纤维细胞分泌HGF影响的研究.山西医科大学， 2011.

12孙晓军,孟焕新,陈智滨,等.侵袭性牙周炎患者血浆白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α的检测.北京大学学报(医学版),2008,40:24-27.

13Lin CC,Shieh DE.The anti-inflammatory activity of Scutellaria rivularisextracts and its active components,baicalin,baicalein and wogonin.Am JChin Med,1996,24:31-36.

14Chou TC,Chang LP,Li CY,et al.The antiinflammatory and analgesic effectsof baicalin in carrageenan-evoked thermal hyperalgesia.AnesthAnalg,2003,97:1724-1729.

15曹正国，李成章，刘小平，等.中药黄芩苷对人牙周膜细胞增殖和总蛋白含量的影响.口腔医学研究,2003,19:12-14.

16鲁红，吴织芬，孙玲变，等.替硝唑局部缓释药膜治疗成人牙周炎的临床研究.实用口腔医杂志,2001,17: 473-475.

Effects of baicalin on the expression levels of interleukin-1β in gingival tissues and peripheral blood of rats with periodontitis

LIHuiying,LIGuoxing,CUIJia,etal.

DepartmentofStomatology,HebeiProvincialChildren’sHospital,Shijiazhuang050031,China

ObjectiveTo observe the effects of baicalin on the expression levels of interleukin-1β in gingival tissues and peripheral blood of rats with periodontitis that is induced by colibacillus lipopolysaccharide.MethodsFifty SD rats (8-week age) were randomly divided into five groups:control group (group A), periodontitis group (group B), baicalin treatment groups (group C1,C2,C3),with 10 rats in each group.After 1-week treatment,all the rats were sacrificed and gingival tissues and peripheral blood specimens were taken,and the expression levels of IL-1β mRNA in peripheral blood of rats were measured by cytometric bead array (CBA),which in gingival tissues of rats were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) technique.ResultsThe expression levels of IL-1β mRNA in gingival tissues and peripheral blood of rats in group B were significantly higher than those in group A (P<0.05). Moreover the expression levels of IL-1β mRNA in gingival tissues and peripheral blood of rats in group C1,C2,C3 were significantly lower than those in group B (P<0.05).ConclusionThe baicalin can decrease the expression levels of IL-1β mRNA in gingival tissues and peripheral blood of rats with periodontitis,and can improve the injury effect of lipopolysaccharide on gingival tissues of rats.

baicalin; periodontitis; interleukin-1β; rats

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.21.001

项目来源：河北省中医药管理局中医药类科研计划项目(编号:2013181)

050031石家庄市,河北省儿童医院口腔科

刘学聪，050031石家庄市，河北省儿童医院口腔科；E-mail:lgxlhy@163.com

R 781.4

A

1002-7386(2016)21-3205-04

2016-03-18)