灭菌设备、容器对样品试剂损失量的影响

◎邓倩南，刘学文，林雅慧，陈海宁，余构彬，高裕锋

（广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所），广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，国家糖业质量监督检验中心，广东 广州 510316）

灭菌设备、容器对样品试剂损失量的影响

◎邓倩南，刘学文，林雅慧，陈海宁，余构彬，高裕锋

（广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所），广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，国家糖业质量监督检验中心，广东 广州 510316）

为考察灭菌设备和容器对样品试剂损失量的影响，修正样品试剂加入量提供依据，利用三种灭菌设备在相同的灭菌条件下（121 ℃，15 min）对四种容器盛装的不同样品试剂进行灭菌实验，比较试剂损失的差异性。经过灭菌实验，各种样品试剂的体积都有一定程度的损失，不同品牌的灭菌设备试剂损失量不同，不同盛装容器试剂损失量存在差异。微生物检测前的灭菌实验应该对灭菌设备和容器对样品试剂损失量的影响进行验证，确保试剂在灭菌完成后达到最适的体积和浓度。

灭菌设备；容器；微生物实验；试剂损失量

灭菌是微生物实验最基础、最重要的一个环节，无菌操作贯穿于微生物实验的始终。在各种灭菌方法中，压力蒸汽灭菌是使用最广泛的一种［1，2］。微生物检测实验中往往需预先定量配制好各种试剂（培养基、生理盐水等），进行灭菌操作后再进行培养等后续工作。与灭菌后再进行分装相比，这种灭菌方式可以减轻工作量，同时避免分装对溶液造成二次污染［3］。然而在实际操作中，由于灭菌设备和容器造成样品试剂质量或体积的变化可能影响后续检测实验结果的准确性。在菌落总数检测中，由稀释液误差带来的不确定度是影响测量结果准确性的主要因素之一［4］。以副溶血性弧菌为例，它作为一种嗜盐性细菌，对盐浓度环境要求严格，3%氯化钠碱性缓冲蛋白胨水作为测定副溶性弧菌的关键试剂，其浓度的改变直接影响实验的成功与否［5］。

为考察灭菌设备和盛装容器对样品试剂损失量的影响，实验选取了常用于食品中菌落总数检测的PCA营养琼脂培养基、磷酸缓冲液和生理盐水［6］，及用于食品中副溶血性弧菌检测的3%氯化钠碱性缓冲蛋白胨水，使用3个不同品牌的灭菌锅在4种不同盛装容器进行灭菌实验。获取各种实验条件下试剂损失的情况，为修正样品试剂加入量提供依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

PCA营养琼脂培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；3%氯化钠碱性缓冲蛋白胨水、磷酸缓冲液干粉，购自北京陆桥技术股份有限公司；0.85%生理盐水（自制）；纯水（实验室用水）；枯草芽孢杆菌生物指示剂购自广州康龙生物有限公司。

1.2 主要仪器

LDZX型立式压力蒸汽灭菌锅：Ⅰ号锅，上海申安医疗器械厂生产；高压灭菌锅GI36DS：Ⅱ号锅，致微（厦门）仪器有限公司生产；不锈钢立式压力蒸汽灭菌器YM50Z：Ⅲ号锅，上海三申医疗器械有限公司生产；电子天平：梅特勒；250 mL聚丙烯耐高温广口塑料试剂瓶；250 mL锥形瓶；封口膜；耐高压橡皮筋；15 mm×100 mm普通试管；硅胶塞；试管盖帽；250 mL量筒；自动分液器。

1.3 方法

PCA营养琼脂培养基、3%氯化钠碱性缓冲蛋白胨水、磷酸缓冲液按商品说明书加水溶解配制，将锥形瓶、塑料试剂瓶、盖帽试管和硅胶塞试管干燥标记后称重并记录空瓶质量，并加入相应量的试剂，称重，记录为灭菌前质量，各容器的试剂添加量见表1。

表1 四种容器的试剂添加量表

平均分成3组，分别置于3种灭菌锅中，同时加入枯草芽孢杆菌生物指示剂于121 ℃，15 min高压灭菌。灭菌完成后干燥，冷却至室温后称重，记录为灭菌后质量。每种高压锅重复10次实验，结果取10次平行的算术平均值。

1.4 损失率的计算

式中：

N——试剂损失率；m1——空瓶质量；m2——灭菌器质量；m3——灭菌后质量。

2 结果与讨论

经灭菌后，生物指示剂中的孢子均被完全杀灭［7］，三种灭菌锅的灭菌效果均为满意，灭菌性能正常。用锥形瓶瓶盛装的PCA营养琼脂培养基、3%氯化钠碱性缓冲蛋白胨水、磷酸缓冲液和生理盐水在三种灭菌锅中的损失结果见表2。

表2 锥形瓶中灭菌溶液损失率表（%）

Ⅱ号锅试剂的损失率明显要比Ⅰ号锅和Ⅲ号锅都小，Ⅰ号锅和Ⅲ号锅每一种溶液的损失率都在5%以上；添加了琼脂的试剂经灭菌后比没有添加琼脂的试剂损失的成分更少。

用塑料试剂瓶盛装的灭菌溶液损失率见表3。

表3 塑料试剂瓶中灭菌溶液损失率表（%）

通过对比表2和表3可以看到，在同样的灭菌环境中塑料试剂瓶要比锥形瓶更有效地防止试剂的损失，低溶度液体的损失率要比高浓度液体的损失率大。

采用不同的试管塞经灭菌后试管内试剂的变化情况见表4，使用试管盖帽的生理盐水要比使用硅胶塞的生理盐水损失得少，但是差异不大，损失率都在5%以内；两种加盖方式的试管都比使用锥形瓶和塑料试剂瓶的损失率要低。

表4 试管中生理盐水损失率表（%）

在食品安全国家标准中，PCA营养琼脂培养基、磷酸缓冲液和生理盐水常用于食品中菌落总数的测定，225 mL磷酸缓冲液、225 mL生理盐水和9 mL生理盐水是广泛使用的样品稀释液，这也要求其用量的准确性，尤其是在对处于临界值的样品进行菌落总数的测定时，如果稀释液的实际用量是偏低的话，则会造成结果偏高，容易误判。3%氯化钠碱性缓冲蛋白胨水用于副溶血性弧菌的定性和定量检验，而副溶血性弧菌是一种对盐敏感的食源性致病菌，在含盐量0.5%～8%的环境中方可生长，在含盐量2%～4%中生长迅速［8］。按商品说明书进行配制的3%氯化钠碱性缓冲蛋白胨水经高压灭菌后，水分有一定的损失，造成氯化钠浓度偏高，使得副溶血性弧菌生长变缓慢或不生长，从而影响了结果的准确性。

3 结论

试剂经高压灭菌锅灭菌后都会有一定程度的质量损失，每种试剂在不同灭菌锅中的损失量也不同，同一试剂用不同容器盛装在同一灭菌锅中的质量损失也不同，因此，在实验开始前，实验室应该对这些可能影响实验结果的因素进行评估和验证。对用量要求相对严格的培养基可在灭菌前增加相应的量以抵消灭菌过程中的损失，而对浓度要求相对严格的培养基则应在配制时增加相应的水分，确保灭菌完成后培养基的浓度在合理范围内。

［1］刘胜国，余裕娟，罗艺辑.培养皿高压蒸汽灭菌效果不佳的原因探讨［J］.中国卫生检验杂志，2007，17 （7）：1309-1310.

［2］张洁静，陈 攀.冷空气对灭菌器检测结果的影响［J］.上海计量测试，2015，（3）：51-52.

［3］秦霄雯，李凤霞，胡方峥.大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）质量控制程序［J］.医疗装备，2015， 28（17）：33-34.

［4］刘 峥.食品中菌落总数测量的不确定度评定［J］.中国保健营养旬刊，2013（5）：42.

［5］国家卫生和计划生育委员会. GB 4789.7-2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验［S］.北京：中国标准出版社，2013.

［6］国家卫生和计划生育委员会. GB 4789.2-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定 ［S］. 北京：中国标准出版社，2010.

［7］肖 璜，郭志龙，夏梦菲，等.自含式压力蒸汽灭菌生物指示剂孢子计数方法的考察［J］.中国药师，2015，18（7）：1110-1112.

［8］周鹏飞.不同浓度盐环境对副溶血性弧菌生长的影响［D］.安徽：安徽科技学院，2012.

The Influence of Sterilizing Equipments and Containers on the Loss of Reagents

Deng Qiannan， Liu Xuewen， Lin Yahui， Chen Haining， Yu Goubin， Gao Yufeng
（Department of Guangdong Bioengeneering Institute， Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute， Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement and Bio-refinery， China Sugar Inspection Center ， Guangzhou 510316， China）

In order to investigating the in fluence of sterilizing equipment and container on the loss of reagents and correcting the amount of reagents， four different reagents are sterilized using three kinds of equipments in different containers under the same condition （121 ℃ ， 15min）， and the loss of reagents are compared. After the sterilization experiment， all reagents have certain quantity of loss， and the quantities of loss of reagent are different in different sterilization equipments and containers. Before the microbial testing，the effect of sterilization equipment and containers on the loss of sample reagents should be verified to make sure the reagent have optimal volume and concentration after sterilization.

Sterilization equipment； Medium； Microbial test； Uncertainty

TS203

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.14.027

广东省省级科技计划项目（编号：2013B040400003）；广东省省级科技计划项目（编号：2013B061800023）；广东省省级科技计划项目（编号：2013B061800007）； 广东省省级科技计划项目（编号：2014B040404054）；广东省科技计划项目（编号：2016A040403066）；广东省科学院项目（编号：2016GDASPT-010）。

邓倩南（1989-），男，本科，助理工程师；主要研究方向为食品检验。

高裕锋（1983-），男，博士，高级工程师；主要研究方向为食品检验与标准化。