HPLC法测定赖氨酸磷酸氢钙颗粒中盐酸赖氨酸的含量

林大专 惠 春 孙全乐 殷 玥

（长春医学高等专科学校，吉林 长春 130031）

HPLC法测定赖氨酸磷酸氢钙颗粒中盐酸赖氨酸的含量

林大专 惠 春 孙全乐 殷 玥

（长春医学高等专科学校，吉林 长春 130031）

目的 建立高效液相色谱柱前衍生化法测定赖氨酸磷酸氢钙颗粒中盐酸赖氨酸的含量。方法 采用邻苯二醛（OPA）为衍生化试剂进行柱前衍生化，色谱柱为Kromasil5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.1%三乙醇胺（48∶52）；检测波长为326 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：20 ℃。结果 盐酸赖氨酸在78.6～1100.4 µg范围内线性良好，相关系数γ=0.9995（n=5），平均回收率为100.2%，（RSD=1.59%，n=6）。结论 该方法简单、快速，可作为赖氨酸磷酸氢钙颗粒的质量控制方法。

HPLC法；赖氨酸磷酸氢钙颗粒；盐酸赖氨酸；邻苯二醛柱前衍生化

赖氨酸磷酸氢钙颗粒是由盐酸赖氨酸和磷酸氢钙组成的复方制剂，具有促进幼儿正常生长发育，补充儿童及孕妇钙质的作用。其中盐酸赖氨酸为主要生理活性成分，盐酸赖氨酸本身不产生荧光，且无紫外吸收［1］，通常采用与茚三酮反应比色法测定含量，该法的专属性与稳定性均较差，为该药品的质量控制带来了一定的困难。本文采用邻苯二醛衍生化试剂进行柱前衍生化，利用HPLC法对赖氨酸磷酸氢钙颗粒中盐酸赖氨酸进行含量测定，为该制剂的质量控制提供有效、可行的方法。

1　仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪［Agilent 1200可变波长检测器（VWD），Agilent 1200数据站， G1354A四元梯度泵及G1316A柱温箱系美国Agilent公司产品］；L-赖氨酸盐酸盐对照品（南通飞宇生物科技有限公司，含量98%以上）；邻苯二醛（上海亚太精细化工公司出品，化学纯）；赖氨酸磷酸氢钙颗粒（批号为120601，120602，120603，白求恩医科大学制药厂）；甲醇为色谱纯，三乙醇胺，三乙胺，乙醇均为分析纯，水为超纯化水。

2　方法与结果

2.1溶液制备。0.15%邻苯二醛（OPA）溶液的配制：精密称取邻苯二醛0.1523 g，用少量甲醇溶解，用水定容至100 mL量瓶中，摇匀即得。

对照品溶液的配制：精密称取盐酸赖氨酸对照品0.0795 g，用少量水溶解，用70%碱性乙醇（用三乙胺调pH至10.7［2］）定容至50 mL容量瓶中，摇匀，得对照品溶液。

样品溶液的配制：精密称取样品（每批）约125 mg，用1 mL水溶解，用70%碱性乙醇定容至25 mL容量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液，作为样品溶液。

2.2色谱条件。色谱柱：Kromasil5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%三乙醇胺（48∶52）；检测波长：326 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：20 ℃。

2.3方法学考察。线性试验：精密量取盐酸赖氨酸对照品溶液0.05，0.10，0.30，0.50，0.70 mL于反应管中，加水稀释至1 mL，分别加入0.15%OPA溶液2 mL，密塞后摇匀管内液体，将反应管置于沸水浴中加热1 min［2］，立即冷却至室温，进样20 µL至液相色谱仪，记录色谱峰面积。以盐酸赖氨酸衍生物的峰面积为纵坐标（A），质量为横坐标（m），进行线性回归，回归方程：A=9.6993m-93.021，相关系数r=0.9995（n=5），结果表明盐酸赖氨酸在78.6～1100.4 µg范围内色谱峰面积与质量之间具有良好的线性关系。

精密度试验：精密量取对照品溶液0.5 mL于反应管中，照线性试验同法操作，连续进样5次，结果显示盐酸赖氨酸衍生物峰面积的RSD分别为1.67%（n=5），表明本法精密度良好。

重现性试验：取批号为120601的样品，照样品溶液配制的方法制备样品溶液，精密量取续滤液1.0 mL至反应管中，照线性试验同法操作，注入液相色谱仪，测定峰面积。重复操作6次，结果显示盐酸赖氨酸衍生物峰面积RSD为1.91%，表明本方法重现性良好。

稳定性试验：取批号为120601的样品，照样品溶液配制的方法制备样品溶液，分别于0、3、6 h时精密量取续滤液1.0 mL至反应管中，照线性试验同法操作，测定峰面积。结果显示RSD为1.61%，表明样品溶液在6 h内基本稳定。

加样回收率试验：精密称取批号为120601的样品0.1251 g，照样品溶液配制方法制备样品溶液，精密量取该样品溶液6份，每份0.5 mL，于反应管中，加入对照品溶液各0.2 mL，加水0.3 mL，照线性试验测定方法测定峰面积，计算回收率，结果盐酸赖氨酸的平均回收率为100.2%，RSD=1.59%（n=6）；结果见表1。

表1　盐酸赖氨酸加样回收率试验结果

2.4样品含量测定：依法操作，测得3批样品中盐酸赖氨酸标示量百分含量分别为97.0%（1.28%），98.1%（0.56%），95.0%（0.63%），括号中为每个样品3次测定结果的相对标准偏差。

3　讨 论

采用70%乙醇溶解样品，可以防止在温度较高时，赖氨酸受细菌作用变质，导致其浓度发生变化。本方法为OPA与赖氨酸柱前衍生化法，反应的最佳条件是沸水浴1 min，温度较低OPA与赖氨酸衍生化反应比较缓慢，反应时间过长会导致衍生化产物分解，因此HPLC法测定应在15 min内完成。本法专属性强，回收率好，样品处理简单，因此该法可用于赖氨酸磷酸氢钙颗粒的质量控制。

［1］成丹，李健和，彭词艳，等.高效液相色谱法和非水电位滴定法测定注射用盐酸赖氨酸含量的比较［J］.中国药业，2012，21（15）：51-53.

［2］凌笑梅，刘养清，杜鸣，等.高效液相色谱-紫外检测法测定赖氨酸注射液中赖氨酸含量［J］.沈阳药科大学学报，2000，17（5）：349-352.

R9

B

1671-8194（2016）27-0021-01