回药扎里奴思方联合BMSCs移植对脑缺血再灌注大鼠BBB紧密连接蛋白的影响

刘敬霞， 任非非， 刘会贤， 刘 洋， 李 娟， 虎喜成



回药扎里奴思方联合BMSCs移植对脑缺血再灌注大鼠BBB紧密连接蛋白的影响

刘敬霞1， 任非非1， 刘会贤2， 刘 洋2， 李 娟2， 虎喜成1

目的 观察扎里奴思方联合BMSCs移植对MCAO模型大鼠BBB上Occludin和Claudin mRNA表达的影响。方法 250只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、扎方组、移植组和联合组，除假手术组10只外，其余各组15只；线栓法制备MCAO模型，体外全骨髓贴壁法培养及扩增BMSCs；大鼠灌胃给药[14.6 g/(kg·d)]，BMSCs悬浮液经颈内动脉移植入脑(2×106/200 μl)；移植后1 d、3 d、7 d、14 d取材，干湿重法检测脑含水量，Real time-PCR技术检测Occludin和Claudin mRNA表达。结果 模型大鼠脑含水量较假手术组增加(P<0.01)，Occludin和Claudin mRNA表达降低(P<0.01)；与模型组比较，扎方、移植及联合各3 d、7 d、14 d组脑含水量降低(P<0.01)，各组各时间点Occludin和Claudin mRNA表达增高(P<0.01)；与移植组比较，扎方1 d组脑含水量降低(P<0.05)，3 d组Occludin mRNA表达增高(P<0.01)，7 d组表达降低(P<0.01)，扎方1 d组Claudin mRNA表达增高(P<0.05)，7 d、14 d组表达降低(P<0.01)，联合各组脑含水量均降低，以1 d、14 d明显(P<0.01)，各组Occludin和Claudin mRNA表达均增高(P<0.01)；扎方与联合组比较，联合各组脑含水量降低，以7 d、14 d组明显(P<0.01，P<0.05)，Occludin和Claudin mRNA表达增高(P<0.01)；同组间比较，均以7 d组变化显著，脑含水量呈先增后减趋势，Occludin和Claudin mRNA表达呈先减后增趋势，14 d有明显改善(P<0.01)。结论 脑缺血再灌注损伤后BBB受损，通透性改变，脑水肿形成，以7 d最为明显；扎里奴思方和BMSCs移植均可不同程度改善脑缺血后脑水肿程度，以二者联合应用作用显著，其机制可能与干预Occludin和Claudin mRNA动态表达有关。

脑缺血再灌注； 扎里奴思方； 骨髓间充质干细胞； Occludin mRNA； Claudin mRNA

脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)可发生于多种脑血管疾病过程中，其病理生理机制是涉及多环节、多因素、多途径损伤的复杂的酶促级联反应。而脑内血脑屏障(blood brain barrier，BBB)通透性改变既是损伤后的结果，又是导致损伤进一步加重的重要因素[1]。紧密连接(tight junction，TJ)是存在于BBB上内皮细胞与毛细血管之间的复杂的细胞系统，是BBB的结构基础，对维持BBB生理功能具有重要意义[2]。Occludin和Claudin是组成TJ的主要结构蛋白，是衡量TJ功能变化的重要指标[3]。研究显示，Occludin和Claudin与BBB通透性的调节密切相关，其表达变化可作为衡量BBB损伤程度的标志[4，5]。

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是位于骨髓内除造血干细胞之外的另一类非造血干细胞[6]，具有强大的增殖和多向分化潜能，已成为应用干细胞移植治疗脑缺血损伤领域的热点[7]。扎里奴思方是《回回药方》中记载的治疗脑病的常用方剂，具有芳香开窍，补肾活血功效，能显著调控脑缺血后BBB通透性，改善脑组织损伤程度[8]。本研究拟以SD大鼠为研究对象，观察CIRI大鼠脑内Occludin和Claudin的表达变化及应用扎里奴思方联合BMSCs移植对其变化的影响，探讨联合应用治疗脑缺血损伤的机制，为回医药联合干细胞移植治疗神经系统疾病的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性SD大鼠，250只，清洁级，(350±30) g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，动物合格证号SCXK(宁)2009-0001；所有大鼠于同一动物房中饲养，温度(26±1) ℃，湿度(50±10)%，光暗周期12 h/12 h，自由进食和饮水；常规环境适应性饲养7 d后进行实验。

1.1.2 试剂和药物 培养基DMEM/F-12(美国生命科技公司，批号1292607)，0.25%胰酶(美国HyClone，批号J130020)，胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司，批号051126)，青霉素、链霉素(美国Solarbio，批号20110726)，TRIzol(美国Invitrogen，批号15596-026)，cDNA第一链合成试剂盒(美国Thermo Fisher，批号K1622)，SYBR Green Real time PCR Master Mix(日本TOYOBO)，Agarose(西班牙Biowest，批号111860)，50×TAE电泳缓冲液(南京凯基生物科技发展有限公司，批号KGM020)，氯仿(南京化学试剂有限公司，批号11012710115)，异丙醇(南京化学试剂有限公司，批号12021023041)，DEPC处理70%乙醇(南京凯基生物科技发展有限公司，批号KGDN6)，0.1%DEPC Water(南京凯基生物科技发展有限公司，批号KGDN4500)，尼龙线栓(北京沙东生物科技有限公司，批号2636-4A)，水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，批号20100709)，氨苄青霉素钠(美国Amresco，批号0339)。扎里奴思方出自《回回药方》，组成为：阿你松 (安息香)3 g、法里公(小茴香)12 g、兀沙吉(乳香)12 g、法忒剌撒里荣(当归)12 g、木里(没药)12 g、撒法郎(红花)12 g、阿咱儿公(牡丹皮)9 g、拆不牙剌 (芦荟)12 g、伯思八牙(水龙骨)12 g、祖伐(怀牛膝)24 g、撒的知(肉桂)6 g、腽肭脐(海狗肾)12 g、阿夫忒蒙(菟丝子)12 g、哈咱卜咱里剌(石菖蒲)12 g。制剂由宁夏医科大学附属回医中医院制剂室提供，煎煮滤取并浓缩药液至生药浓度为1.46 g/ml，4 ℃保存备用。

1.1.3 仪器 PM-10AD-倒置相差显微镜(日本Olympus)，T02323-二氧化碳培养箱(美国Sheldon Plumbing Inc. )，YP1201N-电子天平(上海精科天平仪器厂)，BL310/BL21S-分析天平(德国Sartorius)，80-2-台式低速离心机(上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂)，ST16R-高速冷冻离心机(美国Thermo Sorvall)，XW-80A-涡旋振荡器(其林贝尔仪器制造有限公司)，UV-2450-紫外光度仪(日本SHIMADZU)，TC9600-G-普通梯度PCR仪(美国Labnet MultiGene Gradient)，DA7600-荧光定量PCR循环仪(中山大学达安基因股份有限公司)，DYY-6B-核酸电泳仪(北京市六一仪器厂)，Gel Doc XR-凝胶成像仪(美国BIO-RAD)，MDF-U7386S-sanyo超低温冰箱(日本三洋公司)，CU-420-电热恒温水槽(上海恒科技公司)，HS-840U-超净工作台(苏州净化设备有限公司)，GZX-DH·500-BS-电热恒温干燥箱(上海昕仪仪器仪表有限公司)，YY0088-92-微量进样器(江苏欣悦玻璃仪器有限公司)，YXQ-LS-50-立式压力锅(上海博讯实业有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 局灶性脑缺血再灌注大鼠模型制备 参照Longa等[9]的改良线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。10%水合氯醛ip麻醉大鼠，待麻醉完全后，仰卧位固定大鼠，常规消毒手术视野区皮肤，颈前正中切开皮肤，钝性分离左侧颈总动脉(CCA)；分离颈内(ICA)、颈外(ECA)动脉，穿线备用；结扎ECA近心端和远心端，将ECA从中间剪断；结扎翼腭动脉(PA)，于ECA近CCA分叉处剪一小口，将线栓通过小口穿入ICA并缓慢前向推进，直至有阻力感为止，线栓插入深度约为(18.0±0.5) mm；插线成功后留出线栓残端约1 cm，结扎ECA剪口处，缝合皮肤，并在切口处滴注青霉素钠溶液，以防感染。缺血2 h后拆线并缓慢拔出线栓(但未全部拔出ECA)以进行缺血再灌注，后缝合皮肤。假手术组只分离CCA，ICA及ECA，不插入线栓。手术过程中保持大鼠肛温(37.0±0.5) ℃，保持室温(26±1) ℃。术后参考Longa等[9]的5级4分法对模型进行评分：(1)0分，正常，无神经功能缺损症状。(2)1分，不能完全伸展病变对侧上肢。(3)2分，出现Horner征，行走时向病变对侧旋转。(4)3分，行走时向病变对侧倾倒。(5)4分，无自发活动伴意识降低。1～3分者为成功模型。若术中意外死亡、缺血再灌注24 h内死亡、线栓插入过深造成蛛网膜下腔出血的大鼠被剔除。

1.2.2 BMSCs的培养、扩增和移植

(1)悬液收集：将2月龄雄性SD大鼠(250 g)断颈处死，全身浸泡于75%乙醇中消毒10 min。无菌条件下取出股骨、胫骨，剔除表面附着的组织，PBS清洗3次；剪掉股骨、胫骨的骨垢端，露出骨髓腔，用DMEM/F-12培养基(含肝素及青、链霉素)10 ml 反复冲洗骨髓腔，反复吹打后用200目细胞过滤筛过滤，1000 r/min 离心5 min，弃上清；加入含10%FBS的DMEM/F-12完全培养基5 ml 吹打混匀，重悬，收集BMSCs单细胞悬液；(2)培养、扩增：将收集到的BMSCs单细胞悬液以1×108/L细胞浓度接种于25 cm2的培养瓶中，置于37 ℃、浓度为5%的CO2、饱和湿度的培养箱中培养；3～4 d 换液1次，弃去未贴壁细胞后继续培养，倒置显微镜下逐日观察细胞形态及生长；待瓶底贴壁细胞达80%～90%时，弃去瓶内培养基，PBS缓慢洗涤细胞，以清除培养瓶内混杂细胞；加入0.25%胰酶2 ml 消化，于倒置显微镜下观察，待贴壁细胞明显收缩，间隙变大，大部分细胞形态变圆并开始脱落时，加入完全培养基终止消化，结束原代培养；反复吹打培养基，收集细胞悬液至15 ml 离心管中，1000 r/min，离心5 min，弃上清，加入含10%FBS的DMEM/F-12完全培养基重悬，按1：2比例进行传代培养。逐日观察细胞生长状态；(3)重悬、计数：收集第3代细胞，如前法进行消化、离心及PBS漂洗3次，进行细胞重悬并计数，调整细胞浓度至每0.2 ml PBS含细胞数为2×106个备用；(4)移植：建立MCAO模型24 h后，拆线并将剩余线栓残端全部拔出ECA，沿ECA切口将直径0.7 mm密闭式静脉留置针管缓慢插入ECA，缓慢向前推进至ICA前端并结扎；用微量移液器抽取BMSCs单细胞悬液200 μl，对移植组和联合组大鼠经留置针管由缺血同侧的颈内动脉缓慢移植入脑，后拔出留置针，彻底结扎ECA残端，缝合皮肤。

1.3 分组与用药

1.3.1 分组 大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、扎里奴思方组(简称扎方组)、BMSCs移植组(简称移植组)、BMSCs移植联合扎里奴思方组(简称联合组)；后4组根据取材时间点不同又各分为1 d、3 d、7 d、14 d，每个时间点组大鼠15只，假手术组10只大鼠。

1.3.2 用药 假手术组及模型组以同等体积生理盐水灌胃(ig)；模型组颈内动脉给予和移植组同等体积的生理盐水；扎方组于术前4 dig(大鼠ig用药的剂量根据人与大鼠等效剂量换算公式计算，ig体积按照100 g大鼠ig 1 ml 计算，生药用量为[14.6 g/(kg·d)]，配成的混悬液浓度为1.46 g/ml)，再灌注后24 h颈动脉给予生理盐水200 μl；移植组于术前4 d给予和扎方组同等体积的生理盐水ig，再灌注后24 h颈内动脉给予BMSCs悬浮液200 μl(细胞数为2×106个)；联合组于术前4 d给予扎里奴思方ig，再灌注后24 h颈内动脉给予BMSCs悬浮液200 μl。大鼠于术前12 h禁食，不禁水。

1.4 取材 假手术组于术后14 d取材，其余各组根据时间点分别于颈内动脉用药后1 d、3 d、7 d、14 d取材；麻醉大鼠，4%的多聚甲醛溶液进行灌注固定，断头取脑，用4 ℃生理盐水冲洗3次。于冰盘上迅速分离大脑半球，取左侧半球，自额极向后冠状切取3 mm厚脑组织，待测脑组织含水量；再向后冠状切取约3 mm厚脑组织切片，取切片皮质及半暗带脑组织50 mg，置入液氮内保存，待提取总RNA。

1.5 指标检测

1.5.1 脑组织含水量测定 断头取材后，切取的脑组织迅速用电子天平称取湿重，后放入电热恒温干燥箱(100±2) ℃中干燥24 h，称取干重。按如下公式计算。脑组织含水量=(脑湿重-脑干重)/脑湿重×100%。

1.5.2 实时荧光定量PCR检测 取切取的缺血侧脑组织置入1.5 ml EP管中，利用TRIzol试剂盒提取总RNA，紫外光度仪测定RNA含量。采用cDNA第一链合成试剂盒将总RNA反转录成cDNA。取反转录产物采用SYBR Green Real time PCR Master Mix试剂盒进行实时荧光定量PCR反应。以GAPDH为内参，采用20 μl 反应体系，各引物序列如下：GAPDH：F 5’-GGCCTTCCGTGTTCCTACC-3’，R 5’-CGCCTGCTTCACCACCTTC-3’，103bp；Occludin：F 5’-CCAATCATTATGCACCAAGC-3’，R 5’-GAATTTCGTCTTCCGGGTAA-3’，201 bp；Claudin-5：F 5’-GAAATTCTGGGTCTGGTGCT-3’，R 5’-ATATTGTGGTCCAGGAAGGC-3’，101bp。总反应体系包括cDNA 1 μl，SYBR Green 2X Real time PCR Master Mix 10 μl，上下游引物各1 μl，0.1% DEPC Water 7 μl。放入荧光定量PCR循环仪，反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，40 cycle；溶解曲线95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，60.3 ℃ 15 s，60.6 ℃ 15 s。目的基因表达量采用ΔΔCT法进行分析。

2 结 果

2.1 脑组织含水量 与假手术组比较，模型组各时间点脑组织含水量增加(P<0.01)。与模型组比较，扎方、移植和联合各3 d、7 d、14 d组脑组织含水量降低(P<0.01)。与移植组比较，扎方1 d组脑组织含水量降低(P<0.05)，其余各组变化无统计学意义；联合各组脑组织含水量降低，以1 d、14 d组降低显著(P<0.05，P<0.01)。扎方组与联合组比较，联合各组脑组织含水量降低，以7 d、14 d组降低显著(P<0.05，P<0.01)。同组别不同时间点比较，模型、扎方、移植及联合各7 d组脑组织含水量均较1 d、3 d、14 d组增加(P<0.01)，模型、联合各14 d组较1、3 d组有显著性差异(P<0.05，P<0.01)，扎方14 d组较1 d组降低(P<0.01)，移植14 d组较1 d、3 d组变化无统计学意义(见表1)。

2.2 脑组织Occludin mRNA表达 与假手术组比较，模型组各时间点Occludin mRNA表达显著降低(P<0.01)。与模型组比较，扎方、移植及联合各组Occludin mRNA表达显著增加(P<0.01)。与移植组比较，联合各组及扎方3 d组Occludin mRNA表达增加(P<0.01)，扎方7 d组表达降低(P<0.01)。扎方组与联合组比较，联合各组Occludin mRNA表达增加(P<0.01)。同组别不同时间点比较，模型、扎方、移植及联合各组Occludin mRNA表达均成先减后增趋势，扎方、联合各7 d组较1 d、3 d、14 d组降低(P<0.01)，模型7 d组较1 d、3 d组降低(P<0.01)，移植7 d组较14 d组降低(P<0.05)，模型14 d组较3 d组降低(P<0.01)，扎方、联合各14 d组较3 d组增加，变化无统计学意义(P>0.05)(见表2、图1)。

2.3 脑组织Claudin-5 mRNA表达 与假手术组比较，模型组各时间点Claudin-5 mRNA表达显著降低(P<0.01)。与模型组比较，扎方、移植及联合各组Claudin-5 mRNA表达显著增加(P<0.01)。与移植组比较，联合各组及扎方1 d组Claudin-5 mRNA表达增加(P<0.01，P<0.05)，扎方7 d、14 d组表达减少(P<0.01)。扎方组与联合组比较，联合各组Claudin-5 mRNA表达增加(P<0.01)。同组别不同时间点比较，模型、移植及联合各3 d组Claudin-5 mRNA表达均较1 d组增加，扎方3 d组较1 d组降低，差异均无统计学意义(P>0.05)，各7 d 组Claudin-5 mRNA表达均最低，模型、扎方各7 d组均较1 d、3 d、14 d减少(P<0.01)，移植7 d组较14 d组减少(P<0.01)，联合7 d组较3 d、14 d减少(P<0.01，P<0.05)(见表3、图1)。

t为时间点；与假手术组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.05，4)P<0.01；与移植组比较：5)P<0.05，6)P<0.01；扎方组与联合组比较：7)P<0.05，8)P<0.01；与同组别1 d组比较：9)P<0.05，10)P<0.01；与同组别3 d组比较：11)P<0.05，12)P<0.01；与同组别7 d组比较：13)P<0.05，14)P<0.01 (表2、表3同)

表2 扎里奴思方联合BMSCs对大鼠脑组织Occludin mRNA的影响

表3 扎里奴思方联合BMSCs对大鼠脑组织Claudin-5 mRNA的影响

Occludin mRNA

Claudin-5 mRNA

图1 Occludin及Claudin-5 mRNA的real time-PCR扩增曲线及溶解曲线

3 讨 论

BBB是位于脑内血管与组织间的一个复杂结构，主要由脑毛细血管内皮细胞及其间的TJ、基膜和周细胞、星形胶质细胞终足形成的胶质膜和细胞外基质组成，是脑组织与周围环境进行物质交换的通道，对脑内环境稳态的维持至关重要[10]。研究表明[11]，TJ是维持BBB完整性的重要结构基础，其结构和功能的异常对BBB通透性变化起重要作用。TJ由多种蛋白组成，主要包括胞浆黏附蛋白ZO家族(zonula occludens)、跨膜蛋白和细胞骨架蛋白三类[12]。跨膜蛋白又包括咬合蛋白(Occludin)、闭合蛋白(Claudin)和连接黏附分子(junctional adhesive molecule，JAM)三种膜蛋白[13]。

Occludin是1993年由Furuse等[14]最先分离出的第一个TJ跨膜蛋白，由504个氨基酸组成，相对分子质量为65 kDa。Terry等[15]研究证实，Occludin与脑微血管内皮细胞的“屏障”作用密切相关。Claudin是1998年Furuse等发现的另一类新的TJ跨膜蛋白[16]，目前已发现24个Claudin跨膜蛋白成员，相对分子质量在18～27 kDa之间，序列同源性约12.5%～69.7%。研究[17，18]表明，在脑微血管内皮系统中，Claudin-3和Claudin-5含量最高，调节Claudin特别是Claudin-5对于BBB通透性起重要作用。另有研究[19]发现，Occludin和Claudin-5两种蛋白表达在脑缺血再灌注损伤后4 h减少，于损伤后1～2 d逐渐恢复，同时也证实二者表达降低加速了脑缺血后BBB的损伤。本研究显示，CIRI后1 d，大鼠脑组织含水量开始增加，并随时间延长呈上升趋势，在损伤后7 d达高峰，后逐渐降低，但14 d时仍高于1 d水平，表明CIRI后BBB受损，通透性改变，大量水分进入脑组织形成脑水肿，加重脑损伤程度。Occludin mRNA和Claudin-5 mRNA转录水平在CIRI后明显降低，并于损伤后7 d 降至最低，之后逐渐上调，14 d仍低于1 d、3 d，提示CIRI引起Occludin mRNA和Claudin-5 mRNA转录水平的降低是导致BBB通透性改变，损伤程度加重的途径之一。

BMSCs是存在于骨髓中的一类具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，且具有易于体外分离和培养、免疫原性低的特性，能和脑组织整合并定向迁移、分化以促进受损神经细胞再生和修复[20]。因此，BMSCs被认为是干细胞移植治疗脑缺血损伤理想的种子细胞，利用BMSCs移植成为促进损伤后神经元结构和功能恢复的有效途径[21]。但脑内BBB的屏障作用限制了BMSCs进入脑内的数量，影响其治疗作用的发挥[22]。如何有效调控BBB通透性以促进BMSCs进入脑内并向受损部位迁徙和归巢成为应用BMSCs移植治疗CIRI研究的热点。

芳香开窍类药物气味辛香，善于走窜，以开窍醒神、启闭回苏为应用特点，研究[23]表明，该类药物能通过多个途径调控BBB通透性，发挥脑保护作用。扎里奴思方出自《回回药方》，由安息香、小茴香、乳香、当归、没药、红花、牡丹皮、芦荟、水龙骨、怀牛膝、肉桂、海狗肾、菟丝子、石菖蒲等药组成，原书[24]论其“可开窍，净其浑身厚浊风痰，治疗痰盛弱病”，具有芳香开窍、补肾活血功效，其配方中的“香药”应用更是切中中风后邪蒙清窍、风痰阻窍的病机变化，是回族医学治疗脑梗死的常用方剂之一。前期研究[8]显示，该方能有效促进脑缺血后神经功能恢复，减轻脑水肿，减少IgG表达，发挥BBB调控作用。本实验将该方与BMSCs联合应用，结果显示，联合各组脑组织含水量均较扎方、移植组降低，以7 d、14 d降低明显，联合组各时间点Occludin和Claudin-5各mRNA转录水平均较该两组增高。同时，扎方组大鼠脑含水量、Occludin和Claudin-5各mRNA转录水平均较模型组有不同程度改善，表明该方能有效调控CIRI后BBB通透性，促进BMSCs进入脑内发挥脑保护作用，且以两者联合作用显著。提示两者联合在降低脑缺血损伤后脑水肿方面作用显著，其机制可能与影响BBB上TJ跨膜蛋白Occludin和Claudin-5的动态表达有关。

综上所述，扎里奴思方联合BMSCs移植对CIRI大鼠脑内BBB破坏具有协同保护作用，其机制可能与上调TG跨膜蛋白Occludin和Claudin-5各mRNA转录水平有关。

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Effect of Hui Medicine Zhali Nusi Recipe(ZLNS) Combined with Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Transplantation on Expression of Tight Junction Occludin and Claudin mRNA of Blood-brain Barrier in Rats after Cerebral Ischemia Reperfusion Injury

LIUJingxia，RENFeifei，LIUHuixian，etal.

(TraditionalChineseMedicineSchoolofNingXiaMedicalUniversity，Yinchuan750004，China)

Objective To observe the effect of Hui Medicine Zhali Nusi Recipe(ZLNS) combined with bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) transplantation on expression of tight junction Occludin and Claudin mRNA of blood brain barrier(BBB) in middle cerebral artery occlusion(MCAO) rats. Methods SD rats were divided randomly into Sham-operated，model，ZLNS，BMSCs transplantation and ZLNS combined with BMSCs groups；MCAO model was duplicated with nylon thread，BMSCs were cultured and amplified by the whole bone marrow adherence method；Drugs were given to the rats by intragastric administration[14.6 g/(kg·d)]，BMSCs suspension solution were transplanted into brain through carotid artery(2×106/200 μl)；Rat brain was taken out at 1，3，7，14 days after transplantation；Brain water content(BWC) was detected by dry-weight assay，Occludin and Claudin mRNA were detected by real time-PCR. Results The BWC in model groups were obviously increased than that of the sham-operated groups(P<0.01) and the expression of Occludin and Claudin mRNA were obviously decreased(P<0.01)；Compared with the model groups，the BWC at 3、7、14 days in ZLNS，transplantation and combination groups were decreased obviously(P<0.01)，the expression of Occludin and Claudin mRNA in each groups were significantly increased(P<0.01)；Compared with the transplantation groups，the BWC at 1 day in ZLNS group was decreased(P<0.05)，the expression of Occludin mRNA at 3 day in ZLNS group was obviously increased(P<0.01) and was significantly decreased at 7 day(P<0.01)，the expression of Claudin mRNA at 1 day in ZLNS group was increased(P<0.05) and were obviously decreased at 7、14 days(P<0.01)，the BWC in each combination groups were decreased，and were obvious at 1，14 days groups(P<0.01)，the expression of Occludin and Claudin mRNA in each combination groups were significantly increased(P<0.01)；Compared with the ZLNS groups，the BWC were decreased in each combination groups and also obvious at 7、14 days groups(P<0.01，P<0.05)，the expression of Occludin and Claudin mRNA were significantly increased(P<0.01)；Compared with the same group，all changes were remarkable in 7 days group，the BWC was increased firstly and then decreased，the expression of Occludin and Claudin mRNA were opposite to it. All the indicators were improved in 14 days group. Conclusion The BBB was damaged and the permeability of BBB changed after cerebral ischemia reperfusion，the brain edema was formed and was remarkable at 7 days group. Both ZLNS and BMSCs transplantation can improve the brain edema in different extent，the effect is superior by the combination of them，and its mechanism may be related to the regulation of the dynamic expression of Occludin and Claudin mRNA.

Cerebral ischemia reperfusion； Zhali Nusi Recipe； Bone marrow mesenchymal stem cells； Occludin mRNA； Claudin mRNA

1003-2754(2016)01-0054-06

2015-09-29；

2015-11-30

国家自然科学基金项目(No.81260569)

(1.宁夏医科大学中医学院，宁夏 银川 750004；2.宁夏医科大学附属回医中医院，宁夏 吴忠 751100)

刘敬霞，E-mail：ljx199566@163.com

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