天津地区滑舌鳎养殖水体微生物多样性研究

马超++郑德斌++贾磊++张博++肖广侠

摘 要：天津半滑舌鳎工厂化水产养殖已经实现了快速的发展，本文对A1（汉沽地区养殖所用水源）、A2（汉沽区域流水式养殖水体）、B1（汉沽区域循环水系统处理水体）、B2（汉沽区域循环水系统养殖水体1）、Bb（汉沽区域循环水系统病鱼专养池养殖水体）、C1（大港区域循环水系统处理水体）、C2（大港区域循环水系统养殖水体1）、Cb（大港区域循环水系统病鱼专养池养殖水体）8个养殖区域的微生物，利用宏基因组技术对微生物多样性进行研究，初步获取微生物遗传信息。分析方法主要为对16S rRNA的高变区V3区序列进行PCR扩增，并对拼接后的序列进行分析，包括OTUs（Operational Taxonomic Uints）的提取、alpha多样性分析、beta多样性分析等。通过分析可知8个养殖区域的微生物多样性之间存在着一定的差异。

关键词：半滑舌鳎养殖；水体微生物；多样性分析

中图分类号： S966 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20160832010

目前野生半滑舌鳎数量骤减，大部分都为养殖品种。半滑舌鳎工厂化养殖是天津水产养殖的支柱产业之一。其经济价值高，适合工厂化养殖，在我国已形成了较大的养殖规模。半滑舌鳎的养殖环境与半滑舌鳎的生长及病害发生息息相关，因此分析工厂化养殖半滑舌鳎水环境中微生物的多样性，对于研究半滑舌鳎的生长和病害发生有着重要意义。

本文利用宏基因组技术对天津市工厂化养殖半滑舌鳎的水环境中的微生物多样性进行研究，初步获取微生物遗传信息，解读半滑舌鳎养殖水环境中细菌优势类群及其丰度，揭示半滑舌鳎工厂化养殖水环境中的菌群特征，分析其菌群的组成和功能。探讨养殖水环境微生物群落同鱼病之间的关系，探求微生物群落对鱼体健康的影响，以期从养殖池原位环境鉴定并筛选具有潜在益生作用的功能微生物。

1 实验方法

1.1 从样品中提取总DNA后，针对16S rRNA的高变区V3区序列设计特异性引物进行PCR扩增

对扩增后的产物进行提纯，末端修复，连上接头、测序引物后，采用IlluminaMiSeq进行测序。

1.2 分析流程

对于测序所得到的序列，通过去除低质量、接头污染等过程完成数据过滤，得到可信的目标序列，用于后续分析。过滤后的序列，称为Clean data或Clean Reads，将双端测序相应的read1与read2（read1与read2是指分别从5和3端2个方向测序所得到的序列片段）进行拼接；利用软件QIIME 1.8.0版本对拼接后的序列进行分析，包括OTUs（Operational Taxonomic Uints）的提取、alpha多样性分析、beta多样性分析等。

2 结果分析

2.1 数据过滤统计

某些原始序列带有adapter序列，或含有少量低质量序列。经过一系列数据过滤处理以去除杂质数据，得到Clean Reads。Raw Reads包含低质量的序列、接头污染的序列、含N比例大于5%的序列，以及Clean Reads。Clean Reads所占的比例越高，数据质量越好，根据每种序列所占的比例绘制如下柱状图，可以直观地反映数据过滤情况。

2.2 数据量统计

数据经过过滤得到Clean Data，下图为本项目全部样本的Clean Data数据量统计图，可以很直观看出Clean Data数据量已满足要求。

2.3 测序数据质量值分布

为了反映Clean Data的质量，以保证分析的准确性，以Q30/Q20碱基百分比作为指标进行统计，Q30/Q20碱基百分比越大说明测序错误率小于0.1%/1%的碱基在总碱基中的比例越大。下图以所有样本为横轴，以Q30百分比作为对应的纵轴直观地反映了最终过滤后的数据质量，同时也反映了过滤后各个样本的质量的均一性（每个样本的Q30碱基百分比相近）。

为了粗略反映测序过程中测序质量的稳定性，以Clean Reads的碱基位置作为横坐标，每个位置的平均测序质量值作为纵坐标，得到每个样本测序质量分布图：

2.4 物种比较分析

在了解每个OTUs对应的物种后，由于存在同一个物种具有多个不同的OTUs的情况。把具有相同物种分类的OTUs合并到一起，统计不同样品间的物种成分变化，可以了解不同样品之间的菌群多样性。如下柱状图展示的是Phylum level下的各个样品中的物种分布：

2.5 Alpha多样性分析

Alpha多样性展示的是样品内的菌群的多样性情况，包括菌种的类别丰富度以及菌种数目的均匀度。Alpha多样性越高即细菌种类越丰富，细菌数目越均匀则表示此群落愈加稳定。根据4种不同的计算指标在不同的取样深度下求得了alpha多样性chao1度量指标的值，如下图所示：

区域Bb的物种多样性最强，其次为C2和B1，区域Cb和A1的物种多样性最差。

2.6 Beta多样性分析

Beta多样性展示的是样品间的菌群的差异情况，根据样品的物种分布，计算了unweightedUniFrac距离（只考虑各样品中的物种类别差异）和weighted UniFrac距离（考虑了样品之间物种类别差异以及各类别物种的丰度的差异）。

然后，对样品间的距离矩阵进行主成分分析，做出如下的三维PCA图。

3 小结

对A1、A2、B1、B2、Bb、C1、C2、Cb8个养殖区域的微生物，利用宏基因组技术对微生物多样性进行研究，并对拼接后的序列进行分析（OTUs（Operational Taxonomic Uints）的提取、alpha多样性分析、beta多样性分析等），各个区域的物种多样性之间存在着一定的差异，其中区域Bb的物种多样性最强，C2和B1次之，区域Cb和A1的物种多样性最差。

参考文献

[1]Pei，A. Y.et al.Diversity of 16S rRNA genes within individual prokaryotic genomes[J].Applied and Environmental Microbiology，2010（76）：3886-3897 .

[2]Vasileiadis，S.et al.Soil bacterial diversity screening using single 16S rRNA gene v regions coupled with Multi-Million read generating sequencing technologies[J].PLoS ONE，2012（7）：e42671.

[3]Caporaso，J. G. et al.QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J]. Nat Meth，2010（7）：335-336.

[4]Ahn，J.et al.Human gut microbiome and risk for colorectal cancer[J].Journal of the National Cancer Institute，2013（105）：1907-1911.

[5]Adler，C.J.et al.Sequencing ancient calcified dental plaque shows changes in oral microbiota with dietary shifts of the neolithic and industrial revolutions[J].Nat Genet，2013（45）：450-455.

[6]Zhang，J.Kobert，K.Flouri，T.&Stamatakis，A. PEAR：a fast and accurate illumina Paired-End reAdmergeR[J].Bioinformatics，2013（30）：btt593-620.