Box-Behnken 设计优化贵州野生地枇杷总黄酮提取工艺

陈　琳，俸婷婷*，游　婵，李　超

(1.贵州大学 药学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省药食同源植物资源开发研究开发中心，贵州 贵阳 550025；3.贵州省药食两用资源应用开发工程实验室，贵州 贵阳 550025)



Box-Behnken 设计优化贵州野生地枇杷总黄酮提取工艺

陈琳1，2，3，俸婷婷1，2，3*，游婵1，李超1

(1.贵州大学 药学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省药食同源植物资源开发研究开发中心，贵州 贵阳 550025；3.贵州省药食两用资源应用开发工程实验室，贵州 贵阳 550025)

在各单因素实验基础上，以总黄酮提取率为指标，通过Box-Behnken响应面设计考察乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数对地枇杷总黄酮提取工艺的影响，优化贵州野生地枇杷总黄酮提取工艺。结果表明：地枇杷总黄酮的乙醇回流最佳提取工艺条件的酒精浓度为70%，液固比1∶15，提取时间为30 min，提取次数为3次，地枇杷总黄酮提取率为5.09%。按最优提取条件进行3次验证实验，最终地枇杷总黄酮平均提取率5.13%。本文利用乙醇回流提取地枇杷总黄酮工艺操作简便，稳定可行。

地枇杷；乙醇回流提取；Box-Behnken设计

地枇杷(Ficus tikoua Bur)也称地果、地瓜、地石榴，为桑科榕属匍匐木质藤本，茎上生细长不定根，节膨大，花期5～6个月，果期7个月，榕果成熟可食[1]。地枇杷味苦、性寒，清热利湿、活血通络、解毒消肿，主治肺热咳嗽、痢疾、小儿消化不良、风湿疼痛、带下、跌打损伤[2]。榕属植物主要含有萜类、黄酮、香豆素、生物碱等化学成分，国内外对该属植物的药理学研究表明，该属植物具有降血糖、松弛平滑肌、抗肿瘤、抗菌等作用，该属植物具有潜在的药食两用资源开发价值[3]。贵州的地枇杷野生资源丰富，分布区域广泛，并且长期作为苗族的习惯用药材。本实验通过比较不同提取条件对地枇杷总黄酮乙醇回流提取率的影响，在单因素实验基础上，采用Box-Behnken设计优化地瓜藤总地枇杷黄酮的提取工艺，确定最佳提取工艺条件，为贵州野生地枇杷资源的开发利用提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

地枇杷植物采集于贵州省贵阳市花溪区，经贵州大学熊源新教授鉴定为地枇杷Ficus tikoua Bur.的全草。

芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，批号100080-200707)，所用试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

RE-2000A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-95B型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；T6新世纪型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器设备责任有限公司)；SG8200HPT型超声波清理器(上海冠特超声仪器有限公司)；FA 2004型电子天平 (上海良平仪器仪表有限公司)；DGG-9246电热鼓风干燥箱(上海齐心仪器有限公司)；HH-s2s数显恒温水浴锅(金坛市大地自动仪器厂)；DZF-6020型真空干燥箱(上海博讯实业有限公司)。

1.3方法

1.3.1总黄酮的含量测定精密称取芦丁对照品10 mg，置50 mL量瓶中，加无水乙醇适量，超声处理使溶解完全，加无水乙醇至刻度，摇匀，得对照品溶液。准确吸取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分别置于25 mL量瓶中，加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液 l mL，摇匀，放置6 min，加 10%硝酸铝溶液l mL，摇匀，放置6 min，加 4.3% 氢氧化钠溶液10 mL，加水至刻度，摇匀，放置l5 min，以相应试剂为空白，于500 nm处测定吸光度(A)，A为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线[4]，得到回归方程为：y = 0.0125x -0.0027 (R2= 0.9999)。

1.3.2总黄酮提取率的测定将不同提取方法所得提取液浓缩后加无水乙醇溶解定容至100 mL，分别准确吸取定容溶液1 mL，置于25 mL容量瓶中，按1.3.1项下方法测定总黄酮含量，计算总黄酮提取率。

1.4单因素实验考察

1.4.1乙醇浓度称取地枇杷粗粉15份，每份3.0 g，均分为3组，酒精浓度为40、50、60、70、80%，按料液比1∶5加入浸泡过夜，用水浴控制恒温75℃，每次提取60 min。

1.4.2料液比称取地枇杷粗粉15份，每份3.0 g，均分为3组，按料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，加入60%乙醇溶液浸泡过夜，用水浴控制恒温75℃，每次提取60 min，考察料液比对黄酮浓度的影响。

1.4.3提取时间称取地枇杷粗粉15份，每份3.0 g，均分为3组，按料液比1∶15，加入60%乙醇溶液，浸泡过夜，75℃水浴恒温回流提取时间分别为30、60、90、120、150 min，考察提取时间对黄酮得率的影响。

1.4.4提取次数对黄酮得率的影响称取地枇杷粗粉15份，每份3.0 g，均分为3组，按料液比1∶15，乙醇浓度60%寖泡过夜，用水浴控制恒温75℃回流提取90 min，分别为1、2、3、4、5次，考察提取时间对黄酮得率的影响[5]。

1.5响应面设计实验说明

根据Central Composite实验设计原理，综合单因素实验结果，选取酒精浓度、料液比、提取时间和提取次数4个因素为自变量，分别以A、B、C、D代表，每一个自变量的最低、中、高实验水平分别以-1、0、1进行编码，以黄酮得率Y为响应值，进行响应面优化工艺[5-6]。中心点实验5次，因素水平编码见表1。

表1　地枇杷总黄酮提取工艺优选Box-Behnken实验因素水平

2　结果与分析

2.1单因素实验考察

2.1.1乙醇浓度结果总黄酮提取率为2.69、3.15、3.21、2.59、2.55%，表明60%的乙醇使地枇杷总黄酮的提取率达到最大值，增加乙醇浓度后总黄酮提取率反而降低，可能其他非黄酮物质的提取率增加导致总黄酮的提取率反而降低，因此酒精浓度选择在60%为宜。

2.1.2料液比结果总黄酮提取率为2.86、3.21、3.50、3.49、3.42%，表明1∶15的料液比使地枇杷总黄酮的提取率达到最大值，料液比增加后提取率反而降低，可能是非黄酮类物质的溶解增加使得总黄酮提取率反而降低，因此料液比选择在1∶15为宜。

2.1.3提取时间结果总黄酮平均提取率为3.37、3.49、3.73、3.74、3.71%，表明90 min的提取时间使地瓜地枇杷藤总黄酮的提取率达到最大值，90 min以后提取率维持在一定水平，综合考虑时间长短和能源损耗的因素影响选择90 min的提取时间为宜。

2.1.4提取次数对黄酮得率的影响结果总黄酮提取率为3.49、4.09、4.67、4.99、5.03%，表明4次的提取次数使地枇杷总黄酮的提取率达到最大值，增加提取次数后提取率维持在一定水平，综合考虑时间长短和能源损耗的因素影响选择提取次数3次为宜。

2.2响应面设计实验

响应面设计优选地枇杷总黄酮，以总黄酮提取率为考察指标，实验安排及结果见表2。

表2　地枇杷总黄酮提取工艺优选Box-Behnken实验安排

表3　回归模型方差分析

A

B

C

D

E

F

应用Design-Exper 9.0软件对表2数据进行分析，方差分析结果见表3。结果表明，模型的“P>F”值小于0.01，表明二次方程拟合极显著。酒精浓度A、提取时间C的“P>F”值大于0.05，表明其对总黄酮提取率影响不显著，料液比B的“P>F”值在0.01至0.05间，表明其对总黄酮提取率影响显著，提取次数的“P>F”值小于0.01，表明其对总黄酮提取率影响极显著。二次项B2的“P>F”值小于0.01，表明其对总黄酮提取率影响极显著，A2、D2影响显著，C2影响不显著。交互项AC、BC、BD达到显著水平，其他不显著。

回归方程为Y = 4.67000+0.05250A+0.13333B+0.05417C+0.32000d-0.19208A2-0.23333B2+0.09292C2-0.09083D2+0.01500AB-0.24500AC-0.02750AD+0.20000BC-0.04500BD-0.16750CD，整体模型显著水平，P=0.01，表明该二次方程模型达显著水平，拟合良好。

由图可知，提取次数和提取时间对地枇杷黄酮得率的影响较大。利用Design-Expert软件求解方程，计算出地枇杷总黄酮的最佳提取工艺条件的酒精浓度为70%，料液比1∶15，提取时间为30 min，提取次数为3次，地枇杷总黄酮提取率为5.09%。按调整的提取条件进行3次验证试验，最终地枇杷总黄酮平均提取率5.13%，RSD 0.79%与预测值较为接近，说明采用响应面法得到的工艺参数可靠，与实际提取试验结果拟合良好，对实际提取工作具有一定指导意义。

3　结论与讨论

中药有效成分的提取过程往往会受到诸多因素的影响，响应曲面优化法在中药有效成分的提取应用中越来越受到重视[5，7]。本研究发现地枇杷总黄酮乙醇回流提取工艺的主要影响因素为提取次数和提取时间。通过数据统计分析得到地枇杷总黄酮乙醇回流提取工艺最佳条件为酒精浓度70%，料液比1∶15，此条件下提取30 min，重复提取3次，按此预测的最优提取条件进行3次验证实验，最终得到地枇杷总黄酮提取率为5.13%，表明响应面设计得到的理论值与实际实验结果拟合良好，其预测结果科学有效，对实际提取工作的重要指导意义。贵州省野生地枇杷资源丰富，是提供提取黄酮类化合物的优良资源。采用乙醇回流提取法提取贵州地枇杷总黄酮具有提取率较高、操作方便、设备简单且易于实现工业化等优点，也为贵州野生地枇杷资源的有效开发利用提供科学途径与方法。

[1]中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京:科学出版社，2006:156-157.

[2]关永霞，杨小生，佟丽华，等.苗药地瓜藤化学成分的研究[J].中草药，2007，38(3):342-344.

[3]陈胜发，刘彦超，龙凤来.杨榕属植物化学成分研究进展[J].杨凌职业技术学院学报，2010，9(3):13-17.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典.一部[S].北京:中国医药科技出版社，2010:258.

[5]周向军，高义霞，张霞.响应面法优化黄花菜总黄酮提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2011，17(16):29-31.

[6]侯莉伟，杨凤梅，杨明，等.Box-Behnken设计优化荷叶总黄酮的温浸提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2013，19(18):51-54.

[7]彭晓霞，路莎莎.响应面优化法在中药研究中的应用和发展[J].中国实验方剂学杂志，2011，17(19)：296-299.

Optimization of Extracting Total Flavonoids in Wild Ficus tikoua by Box-Behnken Design

CHEN Lin1,2,3,FENG Ting-ting1,2,3*,YOU Chan1,LI Chao1

(1.School of Pharmaceutical Sciences,Guizhou University,Guiyang,Guizhou 550025,China;2.Medicinal and Edible Plant Resources Research and Development Center of Guizhou,Guiyang,Guizhou 550025,China;3.Medicinal and Edible Plant Resources Application and Development Engineer Laboratory of Guizhou,Guiyang,Guizhou 550025,China)

In this research we tested the effects of ethanol concentration,solid-liquid ratio,time and period of extraction on extraction rateof total flavonoids from F.tikoua by Box-Behnken design to optimize extracting technology based on single factor test.The results showed that,the optimum ethanol reflux extraction conditions of total flavonoids in F.tikouawas as follow:extracting 3 times with the alcohol concentration of 70%,liquid-solid ratio of 15,30 min each time.The yield of total flavonoids was 5.09%.The optimum extraction conditions wasverifiedforthree times,and the average yield of total flavonoids was 5.13%.Extracting total flavonoids from wild F.tikoua by ethanol reflux process is a simple,stable and feasible method.

Ficustikoua;Ethanolreflux extraction;Box-Behnken design

2016-05-03；

2016-05-19

贵州省科学技术基金项目(黔科合J字[2012]2173号)；贵州省科技合作计划项目(黔科合LH字[2015]7666号)；贵州省药食同源资源研究开发科技创新人才团队(黔科合人才团队(2015)4010号)；贵州省药食同源植物资源开发工程技术研究中心(黔科合G字(2015)4001)；贵州省药食两用资源应用开发工程实验室(黔发改投资[2015] 542号)；贵州省中药民族药制药工程专业学位研究生工作站(黔教研合JYSZ字[2014]002)。

俸婷婷(1983-)，博士，副教授，主要研究方向：药理学；E-mail：ftt0809@163.com。

R283.6

A

1008-0457(2016)04-0083-05国际

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.04.015