应用CALUX法测定四川省废弃物焚烧厂飞灰及周边土壤中二噁英类物质含量

许　利, 张嵩岩, 王　维, 田庆华, 张　悦,3, 刘　彦,3

(1. 四川省环境保护科学研究院，成都　610041; 2.中国科学院生态环境研究中心，环境化学与生态毒理学国家重点实验室，北京　100085；3.四川省环保科技工程有限责任公司，成都　610041)



应用CALUX法测定四川省废弃物焚烧厂飞灰及周边土壤中二噁英类物质含量

许利1, 张嵩岩2, 王维1, 田庆华1, 张悦1,3, 刘彦1,3

(1. 四川省环境保护科学研究院，成都610041; 2.中国科学院生态环境研究中心，环境化学与生态毒理学国家重点实验室，北京100085；3.四川省环保科技工程有限责任公司，成都610041)

采集四川省生活废弃物焚烧炉飞灰和企业周边土壤样品10个，应用CALUX生物检测法测定了样品中二噁英类物质的毒性当量。与国内外文献报道值进行比较，结果表明两家废弃物焚烧企业飞灰中二噁英类物质的毒性当量水平较低；企业上风向3 000m土壤背景样品受周围人类活动影响，二噁英类毒性当量值与其它省份土壤背景值相比较高；企业周边1 200m范围内土壤中二噁英类物质的毒性当量值介于9.4～12.16 ng-TEQ/kg，低于国外除农业用地外的其他规划用地标准，与国内上海、杭州焚烧企业周边土壤样品中二噁英类毒性当量一致，但高于广东、江苏和天津焚烧企业周边土壤中二噁英毒性当量值。检测结果为四川省持久性有机污染物的污染防治提供了数据支持，并填补了国内四川省废弃物焚烧企业周边土壤中二噁英含量的数据空白。

二噁英;荧光素酶报告基因法;焚烧;土壤;飞灰

1　前　言

二噁英类物质包含多氯二苯并二恶英(polychlorinated dibenzo-p-dioxins，简称PCDDs)和多氯二苯并呋喃(polychlorinated dibenzofurans，简称PCDFs)两大类有机化合物，共210种异构体。由于其能持久存在于环境中，并具有生物积累和毒害性，被斯德哥尔摩公约列为首批受控的持久性有机污染物。二噁英类的产生主要通过人类的工业活动，其中无组织的废弃物焚烧是目前世界上大部分国家和地区环境介质中二噁英类的主要来源[1]。焚烧烟气中的二噁英类物质通过干、湿沉降于土壤中，被土壤矿物表面吸附和积累，通过食物链使其生物毒性得以传递、放大。因此，土壤最可能成为二噁英类物质传播的集散地[2]。对土壤中二噁英类物质的污染现状调查及趋势研究是非常重要和必要的。

环境中二噁英分析属超痕量、多组分分析，对分析技术的特异性、选择性和灵敏性的要求极高。目前二噁英的测定方法主要有美国环境保护局EPA-1613和1668为代表的HRGC-HRMS、基于抗原-抗体的ELISA法，以及基于总毒性当量(TEQ)的生物检测法等[3]。现阶段国内各相关领域分析二噁英类物质普遍采用HRGC-HRMS，该法通过复杂的前处理过程能够对PCDD、PCDF和PCB等异构体进行精确定量，但是检测成本昂贵、检测周期较长，使其在环境、食品和卫生等领域开展二噁英类物质污染状况调查中的应用受到极大限制[4]。相比之下生物检测法所需要的检测时间短、操作简单、检测费用低，并且能够同时检测更多的样本。生物检测法中，荧光素酶报告基因法(CALUX)作为一种高效快速、简易价廉的生物分析方法，得到了美国EPA推荐使用的二噁英生物学检测方法，并已被欧盟、美国、日本等国广泛用于二噁英的筛选检测中。

国外已广泛开展了土壤环境中二噁英类物质污染调查研究，如美国、日本、荷兰等，并根据土地的使用功能性质制定了土壤中二噁英类物质含量的限值指标。我国目前的研究数据较少，虽有部分省市已开展了相关研究，如上海、浙江、江苏等，但四川省废弃物焚烧企业周边土壤中二噁英类物质含量的调查研究目前还未见报道。因此我们采用了CALUX生物检测方法，调查研究了四川省两座废弃物焚烧企业焚烧炉飞灰及企业周边土壤中二噁英类的含量，并与国内外调查研究数据进行对比，为国内的二噁英调查研究提供数据支持和参考。

2　材料与方法

2.1材料

正己烷、甲苯和丙酮(均为农残级)分别购自美国J.T-Baker 公司，二氯甲烷(农残级)购自Honeywell公司，乙酸乙酯(农残级)、二甲基亚砜(DMSO，for biology)和玻璃棉购自美国Sigma-Aldrich，无水硫酸钠购自日本和光纯药(Wako Pure Chemical)公司，二噁英标准品购自美国willington公司。提取装置采用美国Thermo的加速溶剂萃取装置，型号为ASE 350，净化仪器采用北京普利泰科仪器有限公司的全自动净化装置，型号为JF602。

培养基、盘尼西林(Penicillin-streptomycin)、胎牛血清(FBS)和磷酸盐缓冲液均购自美国Gibco公司，荧光素酶和细胞裂解液购自美国Promega公司，酶标仪购自美谷分子仪器有限公司，型号为SpectraMax®L。

2.2样品采集与分装

本文研究所用飞灰样品来自四川省成都市周边的两座生活废弃物焚烧企业A、B。由于焚烧厂A受耕种农田影响，为避免农药残留对实验结果的影响，焚烧厂B受建筑物遮挡，采样比较困难。因此在1 200m范围内只挑选了三个点位采样，分别为在主导风向下游500m、800m、1 200m处(可能的最大落地浓度区域)布设采样点位。在发生源主导风向上游3km，布设1个点位作为背景值。企业焚烧炉周边土壤采样点的布置分别如图1中A、B所示，共有8个土壤采样点和2个背景值采样点。为提高样品的代表性，采用5点混合式采样，即在每个地点选择一个采样在中心，并在距中心5～10m的4个方向上各选1点，合计5个采样点。清理掉采样点上的树叶植物等覆盖物，用不锈钢小铲采取表层以下5～20cm土壤样品，混合后放入样品袋，置于室内风干，研磨成粉末(小于0.25mm)，四分法取样，装入棕色样品瓶，低温避光保存。其中企业B下风向500m周围为住宅用地，为有效取样，故在周边500～600m范围内选取了三个采样点，分别取样后均匀混合为一个样品。五点混合式采样法如图2所示。

2.3样品预处理与净化

土壤样品预处理流程参照EPA1613方法，如图3所示。ASE提取条件为：提取液为正己烷：二氯甲烷(1∶1(v/v))；温度：150℃，压力：1 500ps，保持7min，静态提取8min， 2个循环。自动净化装置使用北京普利泰科仪器有限公司提供的成品净化柱，串联顺序依次为酸性硅胶柱、铝柱和活性炭柱。淋洗方法：用20mL正己烷分别预淋洗三个串联柱，再用20mL甲苯预淋洗活性炭柱，再用20mL正己烷分别预淋洗三个串联柱，加样后用10mL甲苯淋洗活性炭柱，分离出PCDD/Fs。收集淋洗液，旋转蒸发浓缩，用200μl DMSO定容。

2.4CAULX生物检测

进行生物试验时，从加了200μl DMSO的样品中取出4.5μl，加入450μl PRMI 1640培养液(1% Penicillin-streptomycin+8% FBS)后混匀。在已放置有细胞Hepa 6.1的96孔板上每孔加入100μL混合液，培养20～40 h(37℃，体积分数为5%的CO2)。采用化学发光酶标仪测量发光度，通过发光度计算PCDD/Fs浓度。

图1　焚烧厂A、B周围土壤取样点位示意Fig.1　Sampling points scheme of the two municipal solid waste incinerations (MSWIs)

图2　五点混合式采样法示意Fig.2　Schematic diagram of five hybrid sampling method

图3　土壤样品预处理流程图Fig.3　Flow diagram for the pretreatment of the soil samples

3　实验结果

3.1荧光素酶表达基因法原理以及其毒性当量因子

CALUX方法是基于基因工程技术，把哺乳动物的细胞色素P450基因启动子(CYP1A1)和萤火虫的荧光酶合成基因，重组到大鼠肝癌细胞系(H4IIE)染色体上。脂溶性二噁英类污染物透过细胞膜与细胞内多环芳烃受体可逆性结合，形成配体-AhR复合物，使AhR的构象发生改变，进入细胞核内。在细胞核内配体-AhR复合体和核内转运蛋白(ARNT)结合，形成配体-AhR-ARNT复合物，特异性的与染色体上的二噁英应答区域结合，并激活细胞合成荧光素酶[3]。该测试系统合成的荧光素酶量及荧光强度与测定系统中加入的二噁英量成正相关，系统中的荧光强度可以通过酶标仪进行读取。

由以上原理可以看出，CALUX方法中合成荧光素量及荧光强度实际与二噁英类促使基因表达能力的强弱有关，因此将2,3,7,8-TCDD诱导基因表达的能力定义为1，其他异构体诱导基因表达能力与之相比即为CALUX方法中使用的毒性当量因子(REP)，对应的总毒性当量用TEQ表示，以有别于用HRGC-HRMS检测法使用的总毒性当量I-TEQ[4]。

3.2CALUX标准曲线的绘制以及TEQ的计算

一是朝着管理会计方向发展。过去财务管理依据于企业运作的部分数据，管理人员根据自身经验和市场发展方向加以管理；随着大数据时代的到来，财务管理工作依靠客观性数据，而且数据类型较为丰富，能够为企业提供各个岗位、领域以及过去和未来的真实、准确数据。如预算管理工作，过去财务管理依据会计准则被动性的开展工作，而且预算工作受重视度偏低；现阶段，大数据使得财务管理偏向管理会计方向，不再受到相关会计原则的局限，多数工作和管理人员主动性利用数据做出分析，为企业整体运作提供数据和资料。

CALUX标准曲线可参考文献[4]进行绘制。即将CALUX法中二噁英类检出原理近似与酶反应式相同，并利用酶反应模型Hill公式绘制标准曲线。标准曲线如图4所示。

图4　标准物质浓度应答曲线Fig.4　Dose-response curve of standards determined by CALUX bioassay

3.3实验结果和讨论

3.3.1飞灰中二噁英类含量

企业A、B焚烧炉飞灰及其周边土壤二噁英含量如表1和图5所示，其中飞灰中二噁英毒性当量分别为31.25ng-TEQ/kg和16.11ng-TEQ/kg，大于企业周边土壤中二噁英类毒性当量，且为企业上风向3 000m处土壤中二噁英毒性当量的3.38和3.77倍。与国内外生活废弃物焚烧厂飞灰中二噁英毒性当量相比，此次采样的两家焚烧厂飞灰中二噁英毒性当量较低，具体参考指标见表2所示。可能的原因是由于这两家企业均为2012年投资建成的，引进了世界先进的焚烧炉和烟气净化技术和设备，代表了四川省城市生活废弃物焚烧行业的清洁生产水平。目前世界各国还没有垃圾焚烧炉飞灰中二噁英的控制标准，一般是参照土壤中的控制标准来处理。参照我国《生活垃圾填埋场污染控制标准》 (GB16889—2008)，企业A、B飞灰样品中二噁英类含量均远低于的标准中规定的3 ng I-TEQ/g。

表1　企业A、B焚烧炉飞灰及周边土壤中二噁英毒性当量

3.3.2企业周边土壤中二噁英类物质空间分布及其毒性当量水平

A、B企业下风向周边土壤中二噁英类物质空间分布情况不同。如图5所示，企业A周边土壤二噁英浓度分布规律是距发生源越远，土壤二噁英浓度越低，下风向1 200m左右与土壤背景中二噁英浓度相差不大，说明该企业下风向1 200m以外的区域受二噁英影响不大。企业B周边土壤二噁英浓度分布规律是距发生源越远，土壤二噁英类含量越大，且远大于该厂土壤背景值。出现以上情况的原因可能是由于焚烧厂B下风向800m范围内受建筑物影响，导致这段区域内二噁英浓度偏低，下风向1 200m后为荒地，不受建筑物影响，土壤中二噁英含量升高。而焚烧厂A下风向1 200m范围内无建筑物遮挡，焚烧烟气自然沉降，所以离发生源越远，焚烧厂A下风向土壤中二噁英浓度越低。

企业周边1 200m范围内土壤中二噁英类毒性当量范围介于9.4～12.16 ng-TEQ/kg，与国外参考值比较，此值略高于国外乡村土壤的浓度水平(1-5 ng TEQ/kg)，但低于日本、荷兰的住宅用地标准(1 000ngTEQ/kg)、德国的居民、公园、娱乐设施标准(1 000ngTEQ/kg)。根据采样点土地性质，除了企业A下风向500m和831m范围内有少量农田，土壤二噁英毒性当量略高于瑞典敏感用地外。其余土样根据采样点用地性质，远远低于国外相关标准。具体参考指标见表1。与国内文献报道值相比，焚烧厂A、B1 200m范围内土壤样品中二噁英类毒性当量略高于江苏、浙江、天津和广东等地的废弃物焚烧厂周边土壤中二噁英的毒性当量，但低于上海废弃物企业周边土壤中的二噁英毒性当量。需要说明的是，参考文献中所用的检测方法大部分为HRGC-HRMS方法，而本次调查所用的方法为CALUX生物检测法。根据文献报道，CALUX的实测值高于HRGC-HRMS测量值 1.2～4.5倍[4]。如果按照此倍数进行换算，则换算后的值与中国大部分地区废弃物企业周边土壤中二噁英含量值一致。具体参考指标见表2所示。

表2　中国部分地区土壤背景值和焚烧炉周边土壤二噁英毒性当量值

图5　企业A、B飞灰及周边土壤二噁英类含量空间分布Fig.5　Spatial distribution of dioxins concentrations in the soil around the two municipal solid waste incinerations

4　结　论

应用CALUX法测定了四川省两座废弃物焚烧企业焚烧炉飞灰及周边土壤中二噁英类物质的毒性当量，为四川省持久性有机污染物的污染防治提供了数据支持，并填补了国内四川省废弃物焚烧企业周边土壤中二噁英含量的数据空白。

CALUX法具有操作程序简单、快速，检测灵敏度和准确性等同于HRGC-HRMS、检测范围广、分析费用较低和检测周期短等一系列优势，适用于二噁英样品的快速半定量筛选，可应用于我国大规模的二噁英污染状况调查和相应的健康危害评估。从文献报道来看，国内二噁英检测值均为采用HRGC-HRMS方法得到，相比CALUX方法，HRGC-HRMS测量值偏低，因此用两种方法得到的结果进行比较并不恰当。但是鉴于生物检测法的优点，希望国家行政部门能尽快出台相关的生物检测技术标准，以有利于国内工作者开展土壤筛查和污染识别，并为相关行政部门制定完善的功能区划内二噁英类持久性有机物的污染限值提供参考。

致谢：感谢“全球环境基金‘中国制浆造纸行业二恶英减排项目’”(Project ID: P125528)对四川省二恶英生物检测实验室建设的资助。

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Determination of Dioxins in the Fly Ash and the Surrounding Soil of Two Municipal Solid Waste Incinerations in Sichuan by Chemical-Activated Luciferase Gene Expression (CALUX)

XU Li1, ZHANG Song-yan2, WANG Wei1, TIAN Qing-hua1, ZHANG Yue1,3, LIU Yan1,3

(1.SichuanAcademyofEnvironmentalSciences,Chengdu610041,China; 2.StateKeyLaboratoryofEnvironmentalChemisty&Ecotaxicology,ResearchCenterforEco-environmentalSciences,ChineseAcademyofSciences,Beijing100085,China; 3.SichuanProvinceEnvironmentalProtecionTechnologyEngineering,Chengdu610041,China)

The research took both fly ash and 10 soil samples around two municipal solid waste incinerations (MSWIs) in Sichuan. The simple and low cost CALUX (Chemical-Activated Luciferase Gene Expression) bioassay method was used to fast determine dioxins in the fly ash and the surrounding soils. Compared to the reported TEQ concentrations of the fly ash, background and surrounding soil of the MSWIs at home and abroad, the measured TEQ values were lower in the fly ash of the two MSWIs in Sichuan. Influenced by human activities, dioxin TEQ concentrations were higher in the soil which located on the upwind of dominant wind direction about 3 000m away from the incinerators. However, the TEQ concentrations of the surrounding soil 1 200m away from the incinerators were 9.4～12.16 ng-TEQ/kg, lower than the planning land use standard abroad except for agriculture land standards, higher than the reported values of MSWIs in Guangdong, Jiangsu and Tianjin, etc. province, but consisted with the reported values in Shanghai and Hangzhou city. The testing result provide data for prevention and control of persistent organic pollutants in Sichuan.

Dioxin; CALUX; incineration; soil; fly ash

2016-06-23

许利(1985-)，女，四川成都人，2015年毕业于复旦大学高分子科学系，博士，主要从事环境污染防治研究及环境友好材料的研发应用。

田庆华,tqhtwo@scaes.cn。

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1001-3644(2016)05-0007-06