瓯江彩鲤两种类型鳞片的形态结构比较

许会宾， 张 茜， 王成辉， 龚小玲

(上海海洋大学 省部共建水产种质资源发掘与利用重点实验室， 上海 201306)



瓯江彩鲤两种类型鳞片的形态结构比较

许会宾， 张 茜， 王成辉， 龚小玲

(上海海洋大学 省部共建水产种质资源发掘与利用重点实验室， 上海 201306)

瓯江彩鲤(Cyprinuscarpiovar.color) 鳞片存在不同的类型，其中的两种类型形态差异最为明显。一类鳞片较硬，插入皮肤部分透明，后区光滑，命名为A类；另一类鳞片较软，插入皮肤部分不透明，后区多褶皱，命名为B类。对同规格、同龄、同部位的两种类型鳞片进行比较分析，扫描电镜显示：鳞片上侧区A类鳞嵴排列较B类的规则，同类型、同区域鳞嵴间距之间无显著性差异，而不同类型间则存在显著性差异(F检验得F>F0.01(1,268)=54.095，P<0.01)。石蜡切片显示：相同位点A类鳞片厚度(109.53μm±3.74μm)显著厚于B类鳞片厚度(55.450 μm±7.40 μm，P<0.01)；A类鳞片骨质层明显厚于B类鳞片；A类鳞片纤维层呈现明显的层状分布，而B类鳞片却不分层。数慧眼DigiEye分析鳞片插入皮肤的区域表明：同类鳞片颜色无显著性差异，而A、B两类鳞片颜色则存在显著性差异，可以运用该性状快速而准确地区分它们。结合前期的研究结果可知：A、B两类鳞片形态结构、生化成分以及颜色存在显著性差异，这可能导致了瓯江彩鲤鳞片硬度、透明度及色泽上的不同。

瓯江彩鲤；扫描电镜；石蜡切片；数慧眼

鳞片是鱼类皮肤的衍生物，大部分鱼类体表覆盖鳞片。软骨鱼类被盾鳞，真骨鱼类被骨鳞。瓯江彩鲤(Cyprinuscarpiovar.color)是真骨鱼类，隶属于鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)，原产于瓯江，自然分布于浙江省瓯江流域的龙泉、青田等地，常放养于稻田，在当地俗称“田鱼”，兼具观赏价值与食用价值。瓯江彩鲤体色丰富、肉质细嫩、营养丰富、味道鲜美，且鳞片亦可食用，是鲤科鱼类中的一大瑰宝[1-3]。瓯江彩鲤鳞片存在不同的类型，其中的2种形态差异最为明显，即鳞片较硬、插入皮肤部分透明，后区光滑，命名为形态A；鳞片较软，插入皮肤部分不透明，后区多褶皱，命名为形态B。这一现象在其他鱼类中极为少见。

瓯江彩鲤不同类型鳞片为什么存在差别，前期研究表明这两类鳞片生化成分存在差异[4]，但它们在形态结构上的比较尚无报道。目前在鳞片结构研究上可利用扫描型电子显微镜(SEM)、透射型电子显微镜(TEM)、X射线衍射仪(XRD)等[5-9]，能在分类学和超显微结构上有所突破，此外，在鳞片利用方面也研究颇多[10-12]。本研究采用扫描电镜和石蜡切片技术对瓯江彩鲤两种类型鳞片的表面结构和组织学结构进行比较分析，为瓯江彩鲤鳞片的发育和利用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1实验材料

实验用鱼于2014年1月取自浙江龙泉瓯江彩鲤省级良种场，随机抽取同一生长环境下的1.5龄，两类鳞片的瓯江彩鲤各20尾，鳞片为A类的实验鱼湿重(210.86±13.15) g、体长(20.62±1.51) cm；鳞片B类的实验鱼湿重( 206.79±10.21) g、体长( 19.913±1.08) cm。每尾鱼取鱼体第11～15个侧线鳞以及侧线鳞上、下方两排鳞片，两种形态各取3尾用于扫描电镜，各取3尾用于组织切片，各取5尾用于数慧眼检测。同一实验方法鳞片取样位置相同，编号并置于-20℃冰箱保存。

1.2实验方法

1.2.1实验鱼、鳞片拍照

对鲜活的实验鱼自然光下进行肉眼观察，并在黑色背景下用佳能相机70D进行拍照。

选取A、B类鳞片，超声波震荡仪清洗表面黏液，吸水纸吸干表面水分，置于黑色背景下，拍照。

1.2.2扫描电镜观察

A、B两类鳞片用水冲洗后，用5%NaOH溶液浸泡3～4 h，除去黏液和色素，后用蒸馏水经超声波清洗干净，用两片干净的载玻片压紧，自然干燥48 h，喷金[13-14]，扫描电镜观察并拍照。

先初步扫描观察全鳞片，发现上、下侧区鳞嵴规整，且间距存在差异，选取下侧区中央部位进行鳞嵴间距的测量。相邻鳞嵴间距进行统计，每隔20 μm统计1次，连续记录15个鳞嵴间距，同一鳞片统计3对相邻鳞嵴之间的距离，每个鳞片获得45个数据，单个个体统计3个鳞片，两种类型鱼各选3尾，共获得810个数据。

1.2.3组织切片观察

参照王晓冬等[15]的方法，取A、B两类鳞片用Bouin’s液固定，用于H.E染色和Mallory三色法染色。参照谢松等[16]的方法对A、B类型鳞片10%福尔马林溶液固定，用于硝酸银法染色[17]。将两类鳞片置于固定液12 h后，经70%、80%、90%和95%酒精各浸泡1 h梯度脱水，最后叔丁醇脱水3 h[18]，石蜡横向包埋，切片厚度为10μm。选取质量较好、相同位置的切片进行H.E染色，然后进行鳞片厚度统计，两种类型鳞片各统计3个个体，每个个体统计10个样本数据，共获得60个数据。同样，选取质量较好的切片(同一分析方法选用同一部位的切片)分别进行Mallory三色法染色和硝酸银染色。Mallory三色法染色后主要用于鳞片中胶原纤维的观察，染色后鳞片骨质层呈现蓝色，纤维层呈现黄色，成纤维细胞染成红色；硝酸银染色后，骨质层(羟基磷灰石)染色呈现黑色，胶原纤维呈现粉红色。最后，中性树胶封片，用Olympus IX71生物显微镜镜检，并拍照。

1.2.4数慧眼DigiEye分析

数慧眼DigiEye系统，通过超高分辨率捕捉产品表面结构、颜色，以及外观的数字图像提供标准一致的数据化、稳定化视觉评估方式[19-20]。分别选取两类鳞片清水清洗，超声波震荡仪除去表面黏液及表面色素，实验前处理注意保持鳞片湿润。分别将两类鳞片置于黑色背景下，数慧眼拍照，并进行PCA分析。

1.2.5数据分析

对两种类型鳞片鳞嵴间的距离以及鳞片厚度分别进行组内和组间方差分析和显著性检验，参考文献[21]，采用DPS7.05分析。

2　结果

2.1肉眼观察

鲜活的实验鱼自然光下进行肉眼观察，A类型鱼体表光滑(图1)，发现B类型鱼体表鳞片有明显的褶皱(图2)。取两类鳞片观察并拍照，B类鳞片插入皮肤部分呈乳白色、不透明，A类鳞片无色、透明(图3)。

图1 瓯江彩鲤A类型鱼体Fig 1 Appearance of the form A Oujiang color common carp

图2 瓯江彩鲤B类型鱼体

Fig 2 Appearance of the form B Oujiang color common carp

图3 瓯江彩鲤两种类型鳞片图Fig 3 Appearance of the scales from form A and form B

2.2扫描电镜观察

通过对瓯江彩鲤两种类型鳞片表面结构进行扫描电镜观察，鳞焦、鳞嵴、顶区、基区、上下侧区等鳞片主要结构均清晰可见，对比观察发现两类鳞片上、下侧区的鳞嵴差异明显，选取存在差异的同一结构的同一位置进行分析，选取上侧区进行分析发现：A类型鳞片侧区鳞嵴分布明显比B类型鳞片的规则，A类型鳞片两条相邻鳞嵴之间存在规则的平行分布，每条鳞嵴延伸没有中断(图4-1、2)；而B类型鳞片两条鳞嵴之间大部分不存在规则的平行分布，且少数鳞嵴延伸有中断(图4-3、4)。

1

2

3

4图4 瓯江新鲤鳞片扫描电镜(200×)Fig 4 The SEM result of seales of Oujiang color common carp(200×)

1、2：A类型鳞片(200×)；3、4：B类型鳞片(200×)

对同类型鳞片之间相邻鳞嵴间距离的统计所得数据分别进行组内分析，组内统计数据经DPS7.05Duncan法分析结果见表1。

将两种类型鳞片相邻鳞嵴间距离进行组内方差分析后发现：A类型和B类型鳞片组内均不存在显著性差异，P>0.01。

对两种类型鳞片相邻两条鳞嵴距离分析后发现A形态鳞片鳞嵴平均间距(26.07±1.75)μm，与B形态鳞片(29.78±5.73)μm相差不大。方差分析F检验，F>F0.01(1,268)=54.10，P<0.01，说明两种类型鳞片相邻鳞嵴之间的距离存在显著性差异，不同类型的鳞片鳞嵴之间距离是不同的。

表1 A、B两类鳞片相邻鳞嵴间距离平均值及组内、组间方差分析Table 1 Average data and ANOVA of scales in the same group

2.3组织切片观察

2.3.1 H.E染色结果

通过对切片H.E染色后观察，发现鳞片由鳞囊包围，外包表皮，表皮细胞核清晰可见，鳞片下方可见疏松结缔组织和致密结缔组织，鳞片表面有隆起的鳞嵴。A类型鳞片表皮组织更加致密、细胞间隙更小，见图5。

1

2

图5 两种类型鳞片H.E染色

Fig 5 The H.E staining method result of the scales(100×)

1：A鳞片，H.E染色(100×)；2：B鳞片，H.E染色(100×)。DCT：致密结缔组织；EP：表皮；EPN：表皮细胞核；LCT：疏松结缔组织；RI：鳞嵴；SC：鳞片；SS：鳞囊

对同种类型鳞片相同位置厚度统计所得数据分别进行组内分析，组内统计数据经DPS7.05Duncan法分析结果见表2。

将两种类型鳞片相同位置厚度进行组内方差分析后发现，A类型和B类型鳞片组内均不存在显著性差异(P>0.01)。

对两种类型鳞片厚度组间分析后发现：A类型鳞片厚度(109.76±3.74)μm显著厚于B类型鳞片厚度(55.73±7.40)μm，P<0.01，前者几乎是后者的2倍。方差分析，F检验后，F>F0.01(1,88)=1700.5，P<0.01，表明两种鳞片之间存在显著性差异。

2.3.2Mollary三色染色、硝酸银染色结果

Mallory三色法染色后(图6-1、2)，鳞片表面隆起的鳞嵴清晰可见，上层骨质层为钙盐，呈现蓝色，下层纤维层主要成分为胶原纤维，呈现黄色，但没有观察到被染成红色的成纤维细胞。

表2 A、B两类鳞片厚度平均值及组内、组间方差分析Table 2 Average data and ANOVA of scales

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图6 鳞片染色

Fig 6 Staining of scales

1：A类鳞片Mallory染色(200×)；2：B类鳞片Mallory染色(200×)；3：A类鳞片，硝酸银染色(400×)；4：B类鳞片，硝酸银染色(400×)。BL：骨质层；EP：表皮；EPN：表皮细胞核；FL：纤维层；RI：鳞嵴；SC：鳞片；SS：鳞囊

硝酸银染色后(图6-3、4)，鳞片被鳞囊包被，表皮、表皮细胞核以及鳞片表面隆起的鳞嵴均清晰可见，上层骨质层为钙盐(羟基磷灰石)，染色呈现黑色，下层胶原纤维呈现粉红色。

对切片Mollary染色、硝酸银染色两种染色后观察发现：1)A类鳞片胶原纤维层呈现明显的层状分布，而B类鳞片却不分层；2)A类鳞片骨质层明显厚于B类鳞片。

2.4数慧眼结果

图7中，横坐标为不同的传感器，纵坐标为传感器响应值，从中可以得出，每个样品的响应值都达到了30以上，满足了对数慧眼检测样品的响应值要求；除传感器1366和1637外，其他传感器均存在显著性差异，说明两种形态鳞片颜色存在显著性差异。

图7 两种形态鳞片不同传感器响应值Fig 7 The response values of two scales to different sensors

在图8中，经PCA 分析所得的图主要是以二维散点图来显示，PCA1和PCA2为得到的第一主成分和第二主成分的贡献率，PC1+PC2为95.98%，说明主成分分析结果可以很好地反映不同状态瓯江彩鲤鳞片颜色存在显著性差异(P<0.01)。PCA分析结果显示判别指数(discrimination index，DI)为90。综上所述，两种状态鳞片颜色可以显著性区分。因此推断，鳞片的整体色差可以作为区分两种形态鳞片的指标。

图8 两种类型鳞片主成分分布Fig 8 The PCA result of two forms of scales

3　讨论

3.1鳞片表面结构、切面结构与不同类型鳞片的关系

鳞片扫描电镜的研究主要集中在表面结构的观察，并可以作为分类指标[22-23]。为鳞嵴可以对瓯江彩鲤两个亚种进行区分提供了进一步的支持，但是相邻鳞嵴之间的距离和鳞嵴的排列只能对两种状态鳞片进行显著性区分，但是对鳞片软硬的影响暂时没有相关报道。大多数鱼类的鳞片或者皮肤衍生物，现生真骨鱼类鳞片是由真皮形成的骨鳞[24]。骨鳞上层为骨质层，下层为纤维层[25]。瓯江彩鲤作为鲤科的一种，具有典型的鲤鱼的骨鳞结构，上层为骨质层，下层为纤维层，且排列紧密[26]。但是也有个别鱼类如皇冠珍珠金鱼鳞片表面无钙盐沉积，这与传统骨鳞不同[16]。传统骨鳞上层骨质层，主要成分为羟基磷灰石，亦为钙盐，虽然A类型鳞片骨质层厚于B类型鳞片，但两种类型鳞片中的钙盐比例相差不大[4]，这与A类型鳞片厚度大于B类型鳞片有关。骨鳞下层结构为纤维层，主要成分为胶原纤维，A类型鳞片纤维层呈现明显的层状分布，这两种不同的排列方式可能也是导致鳞片存在软硬的原因。也有报道认为，在透射电镜下骨鳞下层的胶原纤维排列紧密且相互之间呈90°夹角，从而导致鳞片的不同，如条纹鲈[27]。

3.2鳞片厚度、色差与不同类型鳞片的关系

自然干燥后，B类型鳞片边缘呈现卷曲状，而硬鳞则没有这种现象，这是厚度不同造成的现象，厚度不同导致软硬的在其他水生动物中也出现类似情况[28-29]，H.E染色结果已经证明两种类型鳞片厚度存在差异，而导致两种形态鳞片不同的原因也有相关报道是与两种类型鳞片的水含量有关[4]。饲养过程中存在两种类型鳞片，自然光下A类型鳞片呈现明显的透明状，B类型鳞片呈现明显的不透明状，肉眼观察以及通过数慧眼对鳞片整体色差的分析能够将两种类型鳞片明显区分开来，证明色差可以作为区分两种类型鳞片的指标，但是色差是否与导致不同形态鳞片有关，暂时还没有相关报道。

3.3不同类型鳞片的利用前景

通过以上研究可以明显对瓯江彩鲤两种类型的鳞片进行显著性区分，形态结构、生化成分以及色差存在显著性差异可能是导致出现两种类型鳞片的原因，而通过本文中的实验方法对两种类型鳞片进行区分后，结合其他生化指标的报道可以对不同类型的瓯江彩鲤鳞片有效地加以利用。现有的报道已经证明瓯江彩鲤鳞片可以利用于食品行业、饲料加工、医学领域等[30-32]，而通过对不同形态的显著性区分后，可以更加高效地利用瓯江彩鲤鳞片。

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The comparison between two states of Oujiang color common carp，Cyprinus carpio var. color scales

XU Hui-bin, ZHANG Qian, WANG Cheng-hui, GONG Xiao-ling

( The Key Laboratory of Exploration of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education,Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Two obvious conditions exist in the scales of Oujiang color carp,Cyprinuscarpiovar. color. Form one is hard,transparentinsert skin section,smooth back region (named form A)and form two is soft,notsmoothinsert skin section,fold back region (named form B). We analyzed of two types of scales of the same size, the same age and the same parts . The SEM result showed that theformBscalesshowedmore chaotic permutation, and the distances between two scale ridges showedF>F0.01(1,268)=54.095，(P<0.01). The paraffin sections result showed that thethickness of form A scales (109.53±3.74)μm is more thick than the soft scales (55.450±7.40)μm, and the fiber layer of hard scales showed layered distribution,and the bone layer of hard is thicker. The DigiEye result showed that the color is different soft scales and hard scales. There were significant differences between soft scales and hard scales,and these may lead to differences between form A scales and form B scales. On the basis of the previous research results: A, B two types scales morphology, biochemical composition and color in the presence of significant differences, which may resulted in the Oujiang color common carp scales hardness, transparency and color of different.

Oujiang color common carp; SEM; paraffin sections; DigiEye

2016-03-08；

2016-03-29

国家自然科学基金(31372521)；上海市科委项目(15391900800)

许会宾，硕士研究生，主要从事进化生物学，E-mail：xu857932361@126.com

龚小玲，副教授，研究方向为进化生物学，E-mail：xlgong@shou.edu.cn

Q954;S917.4

A

2095-1736(2016)05-0008-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.05.008