介孔分子印迹聚合物分离分析奶粉中的三聚氰胺

臧顺平,吕云辉,苗文凯,陈　浩,刘国一,陈立钢

(东北林业大学理学院,黑龙江哈尔滨 150040)



介孔分子印迹聚合物分离分析奶粉中的三聚氰胺

臧顺平,吕云辉,苗文凯,陈浩,刘国一,陈立钢*

(东北林业大学理学院,黑龙江哈尔滨 150040)

以灭蝇胺为虚拟模板分子,采用溶胶凝胶技术制备灭蝇胺介孔分子印迹聚合物(MIP)。将MIP作为固相萃取吸附剂,与高效液相色谱联用检测奶粉样品中的三聚氰胺。对该聚合物进行了吸附等温线测定以及Scatchard分析,结果表明分子印迹聚合物对三聚氰胺有两种结合方式。计算得到的最大表观结合量(Qmax)和平衡解离常数(Kd)分别为:Qmax1=14.96 mg/g,Kd1=1.85 mg/L;Qmax2=26.16 mg/g,Kd2=27.03 mg/L。最后应用合成的MIP对2 g奶粉样品提取液中痕量三聚氰胺进行净化和富集,回收率为94.73%～98.56%,相对标准偏差RSD为3.2%,检出限为0.015 μg/g。此方法快速、选择性高,为三聚氰胺的残留分析开辟了一条新途径。

介孔,分子印迹聚合物,三聚氰胺,奶粉

三聚氰胺(Melamine)是一种低毒的化工原料。然而它却被不法商人掺杂进食品,如奶粉、冰激凌中,以提升食品检测中的蛋白质含量指标。其进入体内后不能被代谢,一部分从尿液中原样排出,但是由于个人体质不同,有些则会在身体内产生与氰脲酸结合的晶体状聚合物,而引起肾结石、膀胱结石等病症[1-2]。传统检测三聚氰胺的方法是在奶粉样品中加入三氯乙酸和醋酸铅溶液使蛋白质沉淀,过混合型阳离子交换柱(MCX)纯化后,经高效液相色谱分析测定[3],但阳离子交换树脂通过静电引力与三聚氰胺结合,选择性相对较差,萃取率低。即样品中只要能与树脂产生静电引力的物质均可以与其结合,与三聚氰胺的吸附产生竞争。

近年来,分子印迹作为一门新兴技术得到迅速发展。分子印迹聚合物是具有特定功能基团以及孔穴大小和形状的高分子材料,具有稳定性好,耐高温、高压和酸碱的优点[4-5]。目前,已有文献报道[6-8]采用分子印迹技术分离分析三聚氰胺。然而,大多采用本体聚合法来制备分子印迹聚合物[6-7],制得粒子不规则,费时费力,产量低,且印迹位点会包埋在聚合物内部,难以洗脱模板分子,传质阻力较大[9]。此外,当直接采用三聚氰胺作为模板分子制备聚合物时,由于模板分子洗脱不干净,聚合物在应用过程中会造成模板渗漏,从而使检测结果不准确。

介孔材料是指孔径介于2～50 nm的一类多孔材料。该材料具有极高的比表面积、规则有序的孔道结构、狭窄的孔径分布、孔径大小连续可调等特点[10]。若能将分子印迹和介孔两种技术结合起来便可以兼得两者的优点。Lv[11]和Cheng[12]制备得到了介孔分子印迹聚合物(MIP),并分别将其应用于洛美沙星和双酚A的吸附分离。然而,至今尚没有将该技术应用于食品中三聚氰胺分离分析的研究。

本实验采用溶胶凝胶技术以三聚氰胺的结构相似物灭蝇胺为虚拟模板分子,十六烷基三甲基溴化铵为模板导向剂,正硅酸四乙酯为交联剂,3-氨丙基三乙氧基硅烷为功能单体来制备聚合物,该聚合物应用于分离分析奶粉样品中的三聚氰胺。实验方法具有分析快速、选择性高、处理样品和提取操作快速简便等优点。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

三聚氰胺(CAS号:108-78-1,纯度99%)、灭蝇胺(CAS号:66215-27-8,纯度98%)、莠去津(CAS号:1912-24-9,纯度97%)、十六烷基三甲基溴化铵(CAS号:57-09-0,纯度99%)上海阿拉丁;氢氧化钠、盐酸磷酸二氢钾、正硅酸四乙酯、3-氨丙基三乙氧基硅氧烷、甲醇、无水乙醇、乙腈、乙酸均为分析纯,天津科密欧;乙腈色谱纯,美国Fisher;实验用水为去离子水;奶粉购于哈尔滨当地超市。

LC-15C高效液相色谱仪日本岛津;ZORBAX 300-SCX离子交换色谱柱美国Agilent;TU-1800紫外分光光度计北京普析通用;FT-IR360傅里叶红外光谱仪美国Nicolet;TG16-WS台式高速离心机湖南湘仪;KQ-400KDE超声波清洗器昆山市超声仪器;DZF-6050真空干燥箱上海齐欣;pHS-3C pH计上海仪电;DFD-700恒温水浴锅上海树立。

1.2实验方法

1.2.1介孔分子印迹聚合物的制备将2.5 mmol灭蝇胺和1.8 g十六烷基三甲基溴化铵溶解在120 mL水中,再加入2.9 mL 3-氨丙基三乙氧基硅氧烷,11 mL正硅酸四乙酯搅拌30 min,再加入3.5 mL 2 mol/L的氢氧化钠溶液常温反应24 h,抽滤,干燥,合成聚合物。将该聚合物分别经过2 mol/L盐酸-乙醇溶液回流48 h,用以除去十六烷基三甲基溴化铵,水洗、乙醇洗至中性。再用甲醇-乙酸(8/2,V/V)溶液索氏提取聚合物48 h,用以除去模板分子灭蝇胺。真空干燥后,即得到实验所需的介孔分子印迹聚合物(MIP)。

同时制备介孔非分子印迹聚合物(NIP),操作步骤与上述相同,不加入模版分子灭蝇胺。

1.2.2静态吸附等温实验将MIP 20.0 mg置于干净试管中,加入2.5 mL浓度分别为1、5、10、50、100、200、400、500 mg/L的三聚氰胺溶液,振荡吸附12 h,离心分离,滤膜过滤,用高效液相色谱检测溶液中三聚氰胺的剩余浓度。

根据公式:Q=(Ci-Cf)V/m结合前后溶液中底物的浓度变化计算出吸附到聚合物上三聚氰胺的量(Q)。其中Ci(mg/L)为三聚氰胺的初始浓度;Cf(mg/L)为三聚氰胺的平衡浓度;V(mL)为吸附溶液的体积;m为聚合物的质量(mg)。

采用Scatchard分析进一步讨论聚合物的吸附情况,其拟合方程为:Q/Cf=(Qmax-Q)/Kd

其中,Q(mg/g)为聚合物对三聚氰胺的吸附量;Cf(mg/L)为三聚氰胺的平衡浓度;Qmax(mg/g)为最大表观结合量;Kd(mg/L)为结合位点的平衡离解常数。

1.2.3选择性吸附研究应用三聚氰胺及莠去津和灭蝇胺考察介孔分子印迹聚合物的特异性选择能力。分别将20 mg MIP加入到 2.5 mL、50 μg/mL的三聚氰胺、灭蝇胺、莠去津溶液中,振荡吸附12 h,然后采用紫外分光光度计测定吸附后的剩余溶液,从而计算聚合物对这些物质的吸附率。

1.2.4介孔分子印迹聚合物萃取分离奶粉中的三聚氰胺固相萃取柱的制备:2.5 mL注射器底端用脱脂棉作为筛板,防止分子印迹聚合物颗粒的流失。取50 mg介孔分子印迹聚合物,以蒸馏水为匀浆液,进行湿法装柱,然后氮气吹干,制得固相萃取小柱。

向2 g奶粉中加入6 mL丙酮,超声振荡5 min。然后以7000 r/min离心10 min。将离心后的上清液加入到固相萃取小柱,以1 mL/min过柱。然后用2 mL 5%(V/V)氨水-甲醇洗脱。收集洗脱液,氮吹浓缩至干,用色谱流动相定容至0.5 mL,待液相色谱检测。

对实验的条件如萃取剂和洗脱液进行了优化。分别采用丙酮、乙腈和水做萃取剂来萃取奶粉中的三聚氰胺,以及分别采用甲醇、5%氨水-甲醇(V/V)、5%乙酸-甲醇(V/V)作为洗脱液对介孔分子印迹聚合物上的三聚氰胺进行脱附。以三聚氰胺回收率的高低评价不同条件的优劣。回收率通过下式计算:

回收率(%)=样品中三聚氰胺加标之后的总浓度-样品中三聚氰胺的初始浓度/三聚氰胺加标的浓度×100

1.2.5色谱条件色谱柱为ZORBAX 300-SCX(4.6 mm×250 mm,5 μm)离子交换色谱柱;流动相为磷酸盐缓冲溶液(10 mmol/L,pH=3.0)∶乙腈(7/3,V/V);流速为1.3 mL/min;进样体积为20 μL;检测波长为240 nm。

2　结果与讨论

2.1介孔分子印迹聚合物的表征

用KBr压片法,测定介孔分子印迹聚合物在红外区4000～500 cm-1下的吸收谱带,红外光谱图如图1所示,3400 cm-1是O-H的伸缩振动吸收峰;1070 cm-1是Si-O的伸缩振动吸收峰;1620 cm-1是C=O伸缩振动吸收峰。

图1　介孔分子印迹聚合物红外光谱图Fig.1　The infrared spectrogram of mesoporous molecular imprinting polymers

图2　MIP和NIP对三聚氰胺的吸附等温线Fig.2　The adsorption isotherm of melamine of MIP and NIP

2.2吸附等温线的测定和Scatchard分析

由图2所示,随着三聚氰胺浓度的增加,聚合物对三聚氰胺的吸附量也变大,MIP对三聚氰胺的吸附效果大于NIP。

以Q/Cf对Q作图,由图3可知,对于MIP,Q/Cf与Q间存在非线性关系,说明MIP对三聚氰胺的吸附是非均一的,在测定的浓度范围内,聚合物存在两种结合位点。由两条拟合直线的截距和斜率求得:

Qmax1=14.96 mg/g,Kd1=1.85 mg/L;

Qmax2=26.16 mg/g,Kd2=27.03 mg/L。

图3　MIP吸附三聚氰胺的Scatchard分析Fig.3　Scatchard plot analysis of the binding of melamine onto the MIP

由图4可知,对于NIP,Q/Cf与Q间存在线性关系,NIP对三聚氰胺的吸附是均一的,在测定的浓度范围内,聚合物存在一个结合位点。由两条拟合直线的截距和斜率求得:

Qmax=16.32 mg/g,Kd=84.03 mg/L。

图4　NIP吸附三聚氰胺的Scatchard分析Fig.4　Scatchard plot analysis of the binding of melamine onto the NIP

在已有的研究成果中,以三聚氰胺为模板分子采用沉淀聚合法[13]和本体聚合法[14]制备分子印迹聚合物对三聚氰胺的吸附最大表观结合量为22.71 mg/g和6.88 mg/g,而本实验合成的介孔分子印迹聚合物,由于介孔大的比表面积和孔道结构使得对三聚氰胺吸附的总的最大表观结合量为41.12 mg/g,吸附效果更好。

2.3选择性吸附研究

考察介孔分子印迹聚合物对灭蝇胺、三聚氰胺和莠去津(图5)的吸附情况。由图6可知,实验制备的介孔分子印迹聚合物对灭蝇胺和三聚氰胺的吸附作用明显大于非分子印迹聚合物,说明MIP对这两种物质均有良好的选择性吸附。然而,合成的MIP和NIP对于莠去津的吸附则相差较小。这主要是因为三聚氰胺与灭蝇胺的结构相对于莠去津而言更为相似。因此选择灭蝇胺作为虚拟模板分子制备分子印迹聚合物用来分离三聚氰胺是可行的。

图5　三聚氰胺(a)、灭蝇胺(b)、莠去津(c)的分子结构式Fig.5　The molecular structures of melamine(a),cyromazine(b)and atrazine(c)

图6　选择性吸附测试Fig.6　The selectivity absorbing test

2.4萃取实验条件的优化

分别用丙酮、乙腈和水做萃取剂来萃取奶粉中的三聚氰胺。萃取剂的选择结果如图7所示。结果显示,丙酮的效果最好。此外,在丙酮介质中,三聚氰胺可以很好的保留在所合成的介孔分子印迹聚合物上,奶粉萃取完成后,离心得到的萃取液可以直接通过聚合物小柱。而且在此条件下,样品溶液在上样时,没有更多的干扰物质被保留,所以分子印迹聚合物萃取环节,可以省略淋洗步骤,上样后直接用洗脱液进行洗脱即可。

图7　三聚氰胺萃取剂的选择Fig.7　The selection of extraction solvent for melamine

分别采用2 mL的甲醇、5%氨水-甲醇(V/V)、5%乙酸-甲醇(V/V)作为洗脱液对介孔分子印迹聚合物上的三聚氰胺进行脱附实验洗脱液的选择结果如图8所示。结果显示5%氨水-甲醇(V/V)的脱附效果较好,回收率高达98.56%。

图8　三聚氰胺洗脱液的选择Fig.8　The selection elution solution for melamine

2.5分析方法评价与应用

采用高效液相色谱检测三聚氰胺,得到的检测奶粉中三聚氰胺的回归方程为A=115813.5c+773.7(A为峰面积,c为三聚氰胺浓度),R2=0.9999,线性范围为0.025～25 μg/g,检出限为0.015 μg/g。奶粉中加标三聚氰胺的色谱图如图9所示。此外,根据卫生部等5部门2011年第10号公告,三聚氰胺在婴幼儿配方食品中的限量值为1.0 mg/kg,其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5 mg/kg[15],因此,本实验方法满足三聚氰胺检测的需求。从哈尔滨当地超市购买三种奶粉应用本实验方法对三聚氰胺进行检测,没有发现三聚氰胺的存在。随后对奶粉样品进行了三聚氰胺的加标回收实验,得到的回收率在94.73%～98.56%,相对标准偏差RSD为3.2%,本实验检测方法在分离三聚氰胺方面具有一定的应用价值。

图9　奶粉加标三聚氰胺(0. 25 μg/g)的液相色谱图Fig.9　Chromatogram of melamine(0. 25 μg/g)in milk powder

3　结论

本实验以灭蝇胺为虚拟模板分子,采用溶胶凝胶技术制备介孔分子印迹聚合物,对其进行了吸附等温线的测定、Scatchard分析及选择性分析,结果显示对三聚氰胺具有较好的吸附效果。并且由于该聚合物具有介孔结构,因而比表面积大,对三聚氰胺吸附量比传统的分子印迹聚合物高。将实验制得的介孔分子印迹聚合物应用于固相萃取剂萃取分离奶粉中的三聚氰胺,得到了理想的回收率。本实验方法减少了奶粉样品的预处理的步骤,分析速度快,准确度高。

[1]胡虎,盛宏强,马晓琼,等.三聚氰胺及其同系物三聚氰酸的生物学效应和毒理学研究进展[J].浙江大学学报:医学版,2008,37(6):544-550.

[2]王世忠,陆荣柱,高坚瑞,等.三聚氰胺的毒性研究概况[J].国外医学(卫生学分册),2008,36(1):14-18.

[3]赵玉娟,李如华,周文芳,等. UPLC-MRM 法测定饲料中的三聚氰胺[J]. 分析实验室,2009,28(8):119-122.

[4]王斌,王榕妹,王俊卿,等.分子印迹材料研究进展[J].化学研究与应用，2009,22(2):129-135.

[5]李金花,温莹莹,陈令新.分子印迹聚合物固相萃取研究进展[J].色谱，2013,31(3):181-184.

[6]周文辉,林黎明,郭秀春,等.三聚氰胺分子印迹聚合物的制备及奶制品中三聚氰胺的分离[J].分析测试学报，2009,28(6):687-691.

[7]魏艳玲,张嘉慧,贺倩倩,等.分子印迹固相萃取-高效液相色谱法同时测定鸡血浆中环丙氨嗪和三聚氰胺残留[J].分析实验室，2011,30(8):92-96.

[8]贺利民,刘开永,武力,等.分子印迹固相萃取气相色谱-质谱法测定鸡蛋中三聚氰胺[J].中国兽药杂志，2011,45(1):2-5.

[9]牛继伟,荆涛,戴晴,等.分子印迹固相萃取-高效液相色谱法用于奶粉样品中痕量三聚氰胺的残留检测[J].华中科技大学大学报:医学版,2012,41(2):185-189.

[10]刘超,成国祥.模板法制备介孔材料的研究进展[J]. 离子交换与技术，2003,19(4):374-384.

[11]Lv Y K,Liu X H,Yan S L,et al. Synthesis and characterization of the molecularly imprinted mesoporous silica based on the self-assembly technique for selective recognition of lomefloxacin in aqueous solution[J]. Journal of Porous Materials,2013,20(5):1345-1352.

[12]Cheng W,Ma H,Zhang L,et al. Hierarchically imprintedmesoporous silica polymer:An efficient solid-phase extractant for bisphenol A[J]. Talanta,2014,120(1):255-261.

[13]杨卫海,严守雷,卫晨,等.沉淀聚合法制备三聚氰胺分子印迹聚合物微球[J].高分子学报，2010(10):1163-1169.

[14]刘祝娟.硅胶表面三聚氰胺分子印迹聚合物的制备及其分析应用[D]. 哈尔滨:哈尔滨工业大学,2010.

[15]中华人民共和国卫生部,中华人民共和国工业和信息化部,中华人民共和国农业部,国家工商行政管理总局,国家质量监督检验检疫总局. 2011年第10号公告 关于三聚氰胺在食品中的限量值的公告[Z]. 2011.

Separation and analysis of melamine in milk powder by mesoporous molecular imprinted polymers

ZANG Shun-ping,LV Yun-hui,MIAO Wen-kai,CHEN Hao,LIU Guo-yi,CHEN Li-gang*

(College of Science,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China)

Mesoporous molecular imprinted polymers(MIP)was prepared by Sol-Gel technique using cyromazine as virtual template molecule. The MIPs used as solid phase extraction adsorbents were coupled with high performance liquid chromatography(HPLC)to detect melamine in milk powder samples. The results of isothermal absorption experiment and Scatchard analysis showed that there were two kinds of binding sites. By calculating,the values of the apparent maximum absorption capacity Qmaxand the dissociation constant Kdwere as follows:Qmax1=14.96 mg/g,Kd1=1.85 mg/L,Qmax2=26.16 mg/g,Kd2=27.03 mg/L. The melamine in 2 g milk powder samples was purified and enriched by MIP. The recovery of melamine was between 94.73% and 98.56%,relative standard deviation(RSD)was 3.2%,and the detection limit was 0.015 μg/g. This method was rapid and high selectivity,and provided a new way to analyzing residue melamine.

mesoporous;molecularly imprinted polymers;melamine;milk powder

2016-01-18

臧顺平(1996-)，男，本科，研究方向：食品安全分析，E-mail：1935402009@qq.com。

陈立钢(1982-)，男，博士，副教授，研究方向：食品安全分析，E-mail：ligangchen2008@163.com。

黑龙江省青年科学基金(QC2014C005)；东北林业大学国家级大学生创新训练项目(20150225036)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)16-0067-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.004