慢性光线性皮炎患者光生物试验和Arg163Gln初步研究

李秀玲 袁超 杨丽洁 江文才 江长清

200443上海市皮肤病医院皮肤与化妆品研究室

慢性光线性皮炎患者光生物试验和Arg163Gln初步研究

李秀玲 袁超 杨丽洁 江文才 江长清

200443上海市皮肤病医院皮肤与化妆品研究室

目的探讨慢性光线性皮炎（CAD）患者与健康志愿者光试验、光斑贴试验、皮肤颜色相关参数的差异以及与Arg163Gln基因型特征分布关系。方法用日光模拟仪SUN1000、瑞敏牌光斑贴抗原、紫外线光疗仪SS⁃03A和窄波反射分光光度仪对25例CAD患者和25例健康志愿者进行光试验、皮肤色素测定，同时用PCR法行Arg163Gln基因型检测。其中25例CAD患者和5例健康志愿者进行光斑贴试验。结果光试验：CAD患者UVA最小持续性黑化量和UVB最小红斑量均显著低于健康志愿者（P＜0.05），其中UVB最小红斑量更明显（P＜0.01）。光斑贴试验出现阳性反应16例（64%），其中光变态反应13例（52%）。对于4处不同皮肤颜色相关参数的检测，CAD患者面颊部、前额、上臂内侧、手背皮肤的血红蛋白含量均显著高于健康志愿者，而面颊、前额、上臂内侧皮肤的黑素含量差异无统计学意义，仅手背皮肤黑素含量显著高于健康志愿者（P＜0.01），CAD患者曝光部位皮肤黑素和血红蛋白含量均显著高于上臂内侧（P＜0.05）。CAD在Arg163Gln位点突变为CGA比例与健康志愿者相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；CAD在Arg163Gln位点突变为CAA比例与健康志愿者相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。比较Arg163Gln突变为CAA阳性者和CAA阴性者对UVA和UVB的反应性差异，发现Arg163Gln突变为CAA阳性者的UVA最小持续性黑化量（P=0.055）和UVB最小红斑量（P=0.325）均明显低于CAA阴性者。结论皮肤光生物学检查方法在CAD的诊断中具有一定价值。Arg163Gln突变为CAA基因型特征在CAD诊断和防治中有一定的提示作用。

光过敏疾患；色素沉着；基因，Arg163Gln；慢性光线性皮炎；光斑贴试验

慢性光线性皮炎（chronic actinic dermatitis，CAD）是以慢性光敏性为特征的一类疾病，好发于中老年男性。随着全球气候改变，大气平流臭氧层变薄，日光对人们的影响越来越明显，紫外线引起皮肤损伤也有明显增加，CAD发病率增高，发病年龄提前，病程迁延，治疗棘手。在近几十年内，预防和治疗CAD最重要手段是对致病光谱进行防护，皮肤光试验和光斑贴试验是重要的诊断方法［1⁃2］。但在临床应用中，一般测定皮肤最小红斑量（MED）和采用商品化标准抗原进行光斑贴试验，需要一定的光照仪器，以及操作规范的实验人员，并需要患者多次接受试验区域皮肤的评价，方能得出结论。CAD发病与其免疫状况密切相关，是一种由T淋巴细胞介导的迟发型超敏反应。但是，遗传背景差异也是光敏性皮肤病的重要发病原因之一，如能应用特定序列的基因检测技术将人类对UVR敏感程度进行比较与判断，可能对光敏性皮肤病的诊断、治疗及预防提供又一方向。本研究选择拟诊为CAD患者为研究对象，测定患者可能的致病光谱、光敏物质、及皮肤中色素含量和分布状况；同时选择特定基因序列：黑素皮质素受体1（MC1R）的Arg163Gln来观察该序列在上海地区CAD患者中的变异情况。

资料与方法

一、对象

参照 1990 年 Norris和 Hawk［3］诊断标准，入选CAD患者25例，均处于疾病缓解期（缓解期定义为近1周内无新发皮疹，且之前皮疹尚可辨别）。CAD组中，男23例，女2例，病程（18.9±6.4）年，年龄50～ 74（60.5± 5.5）岁；配比健康志愿者25例，男23例，女2例，年龄46～71（60.6±6.6）岁。CAD组与健康对照组在年龄与性别比差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究通过上海市皮肤病医院医学伦理委员会批准，入选者均签署知情同意书。

二、仪器与试剂

1.光试验仪器：日光模拟仪SUN1000（上海希格玛高技术有限公司），测定不同光源下（UVA和UVB）皮肤对光的反应性，光源为1 000 W的短氙弧灯；UVA的发射光谱为320～390 nm；UVB的发射光谱为290～320 nm。

2.光斑贴标准抗原：瑞敏牌光斑贴抗原（瑞典诊断化学公司生产，北京元康医学技术公司经销）进行试验，包括20种光变应原。斑试器为聚乙烯塑料做成的IQ芯室。

3.光斑贴照射仪器：紫外线光疗仪SS⁃03A（上海希格玛高技术有限公司），灯管规格为TLK40W/10R，光源为紫外荧光灯，波段为UVA，峰值为350nm。

4.窄波反射分光光度仪（Mexameter MX18，德国Courage+Khazaka公司）：测定患者不同部位皮肤颜色，包括黑素指数（MI，该值越高，皮肤黑素越多，皮肤越黑）和红斑指数（EI，该值越高，皮肤血红蛋白越多，皮肤越红）。

5.Arg163Gln检测：PCR仪（T100，美国Bio-Rad公司），PrimerSTAR HS DNA Polymerase（DR010A，日本TaKaRa公司），琼脂糖（Agarose G⁃10，西班牙BioWest公司），血液基因组DNA提取试剂盒［DP348，天根生化科技（北京）有限公司］，琼脂糖凝胶回收试剂盒（28704，德国Qiagen公司）：提取人外周血的基因组DNA，通过Arg163Gln位点所在区域特异性引物分离该片段，纯化后测序。

三、方法

1.光试验：日光模拟仪SUN1000对双侧前臂曲侧皮肤进行照射（一侧UVA，一侧UVB），按照不同剂量梯度进行8孔照射（平均递增系数为1.4）。在照射后24 h对照射后MED和最小黑化量（MPPD）进行评价，分别记为UVB⁃MED和UVA⁃MPPD。

2.光斑贴试验：将双份同样的光斑贴标准抗原贴敷于后背对称皮肤，24 h后去除斑贴，再用5 J/cm2能量对一侧皮肤进行照射，在照射后30 min、24 h和48 h对局部皮肤进行判读和记录。

3.皮肤颜色测定：4个部位分别是前额、面颊、手背、上臂内侧。测出患者不同部位的MI和EI。

4.基因诊断相关方法：取每例健康志愿者和CAD患者的300 μl抗凝全血，按照血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA，并检测DNA的纯度和浓度，用特异性引物MC1R⁃220⁃F（ACTGCTTCATCTGCTG CCTGG）和MC1R⁃719⁃R（AGCAGGATGGTGAGGGT GACA）扩增每个个体的Arg163Gln位点所在区域520 bp的片段，纯化后的产物送苏州金唯智生物科技有限公司，用ABI 3730XL自动测序仪检测MC1R Arg163Gln位点的碱基变异，以确定不同个体Arg163Gln位点是GG、AA还是GA基因型。

5.统计：用SPSS13.0统计软件包进行分析。用描述性方法对皮肤光试验和光斑贴试验进行汇总，应用两独立样本均数的t检验比较CAD患者和健康志愿者光试验反应性差异。用χ2检验比较CAD患者和健康志愿者3种不同等位基因出现比例差异和163位点上出现CAA比例的差异。用单因素方差分析法（ANOVA）比较患者4个部位皮肤颜色差异，以及分析163位点上出现CAA（+）和CAA（-）者对UVA、UVB的反应性差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、CAD患者及健康志愿者的光试验结果

CAD患者的UVA⁃MPPD和UVB⁃MED均显著低于健康志愿者（P＜0.05），其中UVB⁃MED更明显（P＜0.01）。见表1。

二、CAD患者光斑贴试验结果

25例患者光斑贴试验结果中，出现阳性反应16例（64%），其中光变态反应13例（52%）；累计出现阳性反应频次30次，其中过敏反应10次，光过敏反应20次；1种变应原阳性6例（37.5%），2种变应原阳性9例（56.3%），＞2种变应原阳性1例（6.25%）；其中1种光变应原阳性11例（68.8%），2种光变应原阳性2例（12.5%），＞2种光变应原阳性1例（6.25%）。患者中阳性率反应较高的5种光变应原为：香料混合物、氯己定、盐酸异丙嗪、秘鲁香脂、6甲基香豆素。见图1。

表1 慢性光线性皮炎患者和健康志愿者光试验结果（±s）

表1 慢性光线性皮炎患者和健康志愿者光试验结果（±s）

注：与健康志愿者比较，a：P ＜ 0.05；b：P ＜ 0.01

组别慢性光线性皮炎患者健康志愿者例数25 25 UVA最小持续性黑化量17.55±9.90a 22.47±4.47 UVB最小红斑量55.74±29.62b 98.61±25.01

三、非创检测皮肤颜色情况

用Mexameter MX18测定4处皮肤颜色，与健康志愿者比较，CAD患者面颊部、前额、上臂内侧、手背皮肤的血红蛋白含量均显著高于健康志愿者，而面颊、前额、上臂内侧皮肤的黑素含量差异无统计学意义，仅手背皮肤黑素含量显著高于健康志愿者（P＜0.01）；CAD患者曝光部位皮肤黑素和血红蛋白含量均显著高于上臂内侧（P＜0.01）；健康志愿者皮肤血红蛋白曝光部位和非曝光部位差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见表2，各部位皮肤黑素和血红蛋白含量比较见图2，3。

比较CAD患者面颊部、前额、手背皮肤与其上臂内侧的黑素和血红蛋白含量分布，发现黑素含量由低到高依次为上臂内侧、面颊、前额、手背；血红蛋白含量由低到高依次为上臂内侧、手背、前额、面颊。上臂内侧的黑素及血红蛋白含量均为最低，而黑素含量最高的是手背，血红蛋白含量最高的是面颊。

四、Arg163Gln检测结果

图1 各变应原所占比例

表2 慢性光线性皮炎患者和健康志愿者不同部位皮肤颜色比较（±s）

表2 慢性光线性皮炎患者和健康志愿者不同部位皮肤颜色比较（±s）

注：a：与自身上臂内侧比较，P＜0.05；b：与健康志愿者同一部位比较，P＜0.05

上臂内侧例数 面颊 前额 手背组别黑素指数慢性光线性皮炎患者健康志愿者红斑指数慢性光线性皮炎患者健康志愿者25 25 252.0±82.5a 215.5±62 260.8±97.2a 216.6±97.2 148.4±41.9 153.3±30.9 325.7±154.9ab 206.9±58.9 25 25 485.4±91.6ab 358.6±44.8 474.5±94.2ab 367.2±38 210.8±57.0b 170.6±39.8 359.9±84.2ab 303.8±78.2

在163位点上，CAD患者在Arg163Gln突变为CGA有3例，而健康志愿者中有6例，两者之间差异无统计学意义（P＞0.05）；CAD患者在Arg163Gln突变为CAA有22例，健康志愿者中也有7例，两者之间差异有统计学意义（P＜0.01）；其他3种等位基因的分布上，CAD患者与健康志愿者差异无统计学意义（P＞ 0.05）。

五、Arg163Gln突变对光反应性的影响分析

比较CAA阳性者和CAA阴性者Arg163Gln突变对UVA和UVB的反应性差异，发现CAA阳性者Arg163Gln突变的UVA⁃MPPD（P=0.055）和UVB⁃MED（P=0.325）均明显低于CAA阴性者。见表3。

讨 论

图2 皮肤黑素含量 与健康志愿者比较，a：P＜0.01

图3 皮肤血红蛋白含量 与健康志愿者比较，a：P＜0.01；b：P＜0.05

表3 慢性光线性皮炎（CAD）患者Arg163Gln突变与光生物学反应差异比较

CAD是一种病谱性疾病，从持久性光反应到光敏性皮炎和光敏性湿疹，严重者可发展为假性淋巴瘤样改变，成为光线性类网织细胞增生症。在欧洲或美国的一些CAD患者跟踪随访都显示，明确CAD诊断后，进行相应正规治疗，大多患者可于5年、10年或15年内获得不同程度康复或好转［4］。因此，在临床上早期诊断对CAD预后及转归有着重要意义。

在CAD患者诊断中，光试验结果是诊断标准中重要条件之一，患者可对UVA或UVB异常敏感，在疾病早期，可能出现最小红斑量的前移，也就是光耐受性降低；光试验结果也是判读患者预后的重要参数。研究认为，对多个光源（尤其是UVB）有异常敏感的患者，其病程较长、预后较差。近年来，人们发现遗传背景差异也是光敏性皮肤病的发病原因之一，人们越来越关注遗传因素对CAD患者发病的影响。国外已有研究发现，黑素皮质素受体1基因多态性与红头发、白皮肤、易晒伤、长雀斑和发生皮肤癌有显性相关［5］。在法国成年女性研究中亦发现，MC1R基因多态性不仅影响皮肤颜色，同时对UVR引起皮肤DNA损伤也非常敏感［6］。因此，本研究选择特定基因序列：黑素皮质素受体1的Arg163Gln对UVR敏感程度进行比较与判断，观察该序列在上海地区CAD患者中的变异情况。

本文光试验结果显示，CAD患者的UVA⁃MPPD和UVB⁃MED均显著低于健康志愿者，其中CAD患者UVB⁃MED降低更明显，说明UVA、UVB均是CAD的致病光谱，CAD患者对UVB更加敏感；CAD患者光斑贴试验的总体阳性率为64%，这与李俞晓等［7］50例CAD光斑贴试验总体阳性率66%比较一致，而 Que等［8］30例 CAD 光斑贴试验阳性率为56.7%，且常见的阳性变应原种类亦与之不同，与Kyu⁃won等［9］检测的CAD常见光变应原为秘鲁香脂，异丙嗪，氯丙嗪和芳香混合物也有一定的差异。我们分析存在差异的原因可能与不同的地域、职业、生活习惯以及样本量的大小等有一定的关系。在皮肤生物学检查-颜色评估中，我们发现，与健康志愿者比较，CAD患者面颊部、前额、上臂内侧、手背皮肤的血红蛋白含量均显著高于健康志愿者，与光试验结果一致，说明CAD患者对UVB较敏感，且UVB是CAD患者的主要致病光谱。而CAD患者与健康志愿者面颊、前额、上臂内侧皮肤的黑素含量差异无统计学意义，仅手背皮肤黑素含量显著高于健康志愿者（P＜0.01），与CAD患者曝光部位的病程反复、炎症反应和炎症后色素沉着有关。CAD患者曝光部位皮肤的黑素和血红蛋白含量均显著高于自身非曝光部位上臂内侧（P＜0.05）。本文小样本研究中发现，CAD患者曝光部位与非曝光部位的生物学参数上差异有统计学意义。在比较CAD患者面颊部、前额、手背皮肤与其上臂内侧的黑素和血红蛋白含量分布中，上臂内侧的黑素及血红蛋白含量均为最低，手背黑素含量最高，面颊血红蛋白含量最高。本实验室既往研究［10］表明，红斑指数是评价日晒伤较为敏感而准确的参数，黑素指数（MI值）是评价晒斑较好的参数。说明CAD患者手背曝光程度可能较其他部位更为严重，防护需要进一步的宣教；而面颊较其他部位，更容易晒伤，对光的敏感性更高。可能与面部皮肤的角质层厚度、神经分布及血管因素等有关。Tagami等［11］统计不同年龄阶段的人在身体不同部位的正常皮肤角质层的细胞层数，发现面部皮肤最薄，仅次于生殖器皮肤。

本研究基因检测结果显示，Arg163Gln突变为CAA是上海地区CAD发病的一个重要遗传背景因素，并且CAA阳性者较CAA阴性者Arg163Gln突变对 UVA、UVB的反应性更加敏感。Suppa等［12］和Elfakir等［13］分别调查797例黑素瘤患者和530例健康的中年法国女性发现，MC1R基因多态性与皮肤的光敏性、日光累积暴露量以及皮肤老化程度密切相关。

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Photobiological responses in patients with chronic actinic dermatitis and their relationship with the melanocortin⁃1 receptor gene Arg163Gln variant:a preliminary study

Li Xiuling,Yuan Chao,Yang Lijie,Jiang Wencai,Jiang Changqing
Skin and Cosmetic Research Department,Shanghai Skin Disease Hospital,Shanghai 200443,China

ObjectiveTo explore differences in phototest and photopatch test results,and in skin color⁃related parameters between healthy subjects and patients with chronic actinic dermatitis（CAD）,and to examine their relationship with the melanocortin⁃1 receptor gene（MC1R）Arg163Gln variant.MethodsPhototests were performed by using a sun simulator SUN1000,and skin color was analyzed by using Hexameter MX18 in 25 patients with CAD and 25 healthy subjects.The MC1R genotype at position⁃163 was determined by PCR.Photopatch tests were performed on 25 patients with CAD and 5 healthy subjects using a standard series of photoallergens（RuiMin）and an ultraviolet（UV）phototherapy equipment,SS⁃03A.ResultsRegarding phototest results,both UVA⁃minimal persistent pigment darkening dose（MPPD）and UVB⁃minimal erythema dose（MED）were significantly lower in CAD patients compared with healthy controls（bothP＜ 0.05）,with the reduction in UVB⁃MED being particularly notable.Sixteen patients（64%）in the CAD group had positive photopatch reactions,including 13（52%）cases of photoallergy.Skin color⁃related parameters were measured at four sites.Skin hemoglobin levels on the cheek,forehead,back of hands,inner upper arms were all significantly higher in CAD patients than in healthy controls（allP＜ 0.05）.However,skin melanin levels on the cheek,forehead and inner upper arms were similar between the two groups,and only those on the back of hands were significantly higher in CAD patients than in controls（P＜ 0.01）.Skin melanin and hemoglobin levels were significantly higher in exposed than in unexposed（inner upper arms）areas in CAD patients（allP＜ 0.05）.The frequency of the CGA genotype at position ⁃163 in the MC1R gene was similar between CAD patients and controls（P＞0.05）,but that of the CAA genotype differed significantly between the two groups（P＜ 0.01）.UVA⁃MPPD and UVB⁃MED were both significantly lower in CAD patients with the CAA genotype at position⁃163 in the MC1R gene than in those without the genotype（P=0.055,0.325,respectively）.Conclusions Skin photobiological testing plays a critical role in the diagnosis of CAD.Further studies are needed to clarify the role of the CAA genotype at position⁃163 in the MC1R gene in the diagnosis,prevention and treatment of CAD.

Photosensitivity disorders;Pigmentation;Genes,Arg163Gln;Chronic actinic dermatitis；Photopatch tests

Yuan Chao,Email:dermayuan@163.com

2016⁃02⁃25）

（本文编辑：吴晓初）

袁超，Email：dermayuan@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2016.10.008

上海市卫计委青年科研项目（20124y057）

Fund program:Youth Fund of Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning（20124y057）