拟南芥P35S：HA—IQM2表达载体的构建与鉴定

程静之　张艺能　周玉萍　黄小玲　田长恩

【摘 要】拟南芥AT3G13600编码的IQM2含有1个IQ基序，是一个钙调素结合蛋白；其突变体表现为迟花表型，是研究钙调素信号参与成花调控的新材料；其C-端与天花粉素同源，可能具有RNA结合活性。为了进一步获得IQM2参与成花调控的证据、研究植物体中与之结合的蛋白及其RNA结合活性，拟构建P35S：HA-IQM2植物表达载体。克隆获得IQM2 cds，利用SalI和SacI过渡到pMD19-SmaI-P35S-HA- SalI-SacI载体上，再利用SmaI和SacI将获得的pMD19-SmaI-P35S-HA-IQM2-SacI载体定向克隆至表达载体pBIH1上，通过PCR和酶切鉴定，证明P35S-HA-IQM2表达载体已构建成功。

【关键词】IQM2拟南芥；P35S：HA-IQM2；表达载体

钙调素信号（Calmoduolin，CaM）是高等植物的一类非常重要的信号，参与多种细胞生理和生长发育调节。田长恩和周玉萍[1]对植物含IQ基序的钙调素结合蛋白（calmodulin-binding protein，CaMBP）的类型及其功能特点等进行了全面的综述。拟南芥IQM家族有六个成员，即IQM1到IQM6，均只含有1个能与钙调素结合的IQ基序（氨基酸序列为IQXXXRGXXXR），N-端与豌豆重金属诱导蛋白6A（Pea Heavy-Mmetal Induced Protein 6A，PHMIP 6A）同源，C-端与天花粉素（Trichosantin）同源，可能具有RNA结合活性[2-3]。其中，IQM2由At3g13600编码[2]。实验证明，IQM2在植物和酵母细胞中都能与CaM5结合，因此是1个钙调素结合蛋白[4-5]。实验室对IQM2进行了生物信息学分析，并克隆得到其cDNA序列[6]，还发现其突变体在长日照条件下呈现迟花表型，暗示IQM2参与成花调控[3]，是研究钙调素信号调控成花的新材料。本文构建P35S：HA-IQM2表达载体，旨在进一步获得IQM2参与成花调控的证据、研究植物体中与之结合的蛋白及其RNA结合活性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌种和质粒：农杆菌菌株由中国农业大学叶德教授惠赠；质粒T-Vector pMD19（Simple）购于TAKARA公司，pBIH1、pMD18-IQM2、pUC19-35S-HA-ARF8由本实验室保藏。试剂盒和工具酶：质粒提取、DNA纯化、胶纯化试剂盒和限制性核酸内切酶均购自TAKARA公司。化学试剂及其他：硫酸链霉素、氨苄青霉素钠、氯化钠、蛋白胨、琼脂粉、蔗糖、酵母提取物等购自生工公司；MS（Murashige & Skoog）salts、潮霉素等购自Sigma公司。测序：由华大基因公司完成。引物合成：由TAKARA公司完成。

1.2 实验方法

质粒提取和DNA片段回收：按照相应试剂盒提供的步骤进行。PCR反应体系及循环参数设置：按照郑景生和吕蓓[7]提供的方法进行。T-A克隆：4.5μL目的片段+ 0.5μLT-Vector pMD19（Simple）+ 5μLSolution I，16℃连接过夜。大肠杆菌转化：按黄永莲和黄真池[8]提供的热激转化法进行。转化子的筛选鉴定：采用菌落PCR筛选阳性转化子，并外送公司测序。

2 结果与分析

以pMD18-IQM2、pUC19-35S-HA-ARF8为模板，分别用SalI-IQM2-F和SacI-IQM2-R、SmaI-P35S-F和HA-R引物组合对其进行PCR扩增，回收产物，进行TA克隆，转化大肠杆菌，转化菌落经PCR筛选获得阳性转化子pMD19- SalI-IQM2-SacI（图1A，约1.8kb）和pMD19-SmaI-P35S-HA-SalI-SacI（图1B，约0.85kb），送华大基因公司测序。

分别用SalI和SacI对测序证实无突变的载体pMD19-SalI-IQM2 cds-SacI和pMD19-SmaI-P35S-HA-SalI-SacI进行双酶切，后者得到具有相应酶切位点的线性化载体，前者割胶回收约1.8kb的IQM2 cds，再将二者连接，转化大肠杆菌，经菌落PCR筛选获得阳性转化子pMD19-SmaI-P35S-HA-IQM2-SacI。

分别用SmaI和SacI对中间载体pMD19-SmaI-P35S-HA-IQM2 cds-SacI和表达载体pBIH1进行双酶切，前者获得约2.6kb的目的片段，后者获得约14kb的线性化载体，分别大体系割胶回收，连接并转化大肠杆菌，经菌落PCR筛选获得阳性转化子P35S：HA-IQM2。

将相应的转化子提取质粒，并进行PCR和酶切鉴定（图2）。在图2中，A和B分别为P35S-HA和IQM2 cds的扩增片段，得到约0.85kb和1.8kb的特异性条带；C为质粒SmaI和SacI双酶切的结果，得到约14kb的载体片段和约2.6kb的P35S-HA-IQM2 cds目的片段。结果表明，P35S-HA-IQM2植物表达载体已构建成功。

3 讨论

课题组发现IQM2含有1个IQ基序，是1个钙调素结合蛋白[2，4-5]；其突变体具有晚花表型，说明其涉及成花调控[3]；其C-端与天花粉素同源，可能具有RNA结合活性[2-3]。不过，与IQM2结合的钙调素还不清楚；IQM2参与成花调控的证据还有待补充；其RNA结合活性尚未明确。因此，有必要构建P35S：HA-IQM2表达载体。本研究成功构建了该载体，在转化IQM2突变体植株，筛选获得转基因纯合子植株后，可通过表型观察，分析IQM2参与成花调控的功能；可利用HA标签钓取与IQM2结合的蛋白；还可利用RNA免疫共沉淀，分析IQM2的RNA结合与降解活性。

【参考文献】

[1]田长恩，周玉萍.植物具IQ基序的钙调素结合蛋白的研究进展[J].植物学报，2013，48：447-460.

[2]Zhou YP， Chen YZ， Yamamoto KT， Duan J， Tian CE. Sequence and expression analysis of the Arabidopsis IQM family[J].Acta Physiol Plant，2010，32：191-198.

[3]张艺能.拟南芥IQM2参与开花调控的功能研究[D].广州：广州大学，2014.

[4]陈羽中.拟南芥IQM2基因功能的初步研究[D].广州：华南农业大学，2010.

[5]王龙涛.拟南芥IQM2基因功能的研究[D].广州：华南农业大学，2012.

[6]陈羽中，周玉萍，蕙，桂林，郭培国，田长恩.拟南芥IQM2 cDNA的克隆与生物信息学分析[J].武汉植物学研究，2010，28：353-358.

[7]郑景生，吕蓓.PCR 技术及实用方法[J].分子植物育种，2003，1（3）：381-394.

[8]黄永莲，黄真池.大肠杆菌感受态细胞的少量制备方法及转化条件研究[J].安徽农业科学，2008，36（11）：4450-4451.

[责任编辑：王伟平]