补充蛋氨酸对星斑川碟生长、血液指标、代谢酶以及体组成的影响

宋志东 李培玉（山东省海洋资源与环境研究院，烟台264006）

补充蛋氨酸对星斑川碟生长、血液指标、代谢酶以及体组成的影响

宋志东 李培玉
（山东省海洋资源与环境研究院，烟台264006）

在含有30%的大豆浓缩蛋白及其酶解物饲料中分别添加晶体蛋氨酸形成4种等氮等能的饲料，分别为大豆浓缩蛋白饲料（SD）、酶解大豆蛋白饲料（ED）、大豆浓缩蛋白补充晶体蛋氨酸饲料（SD-CMET）以及酶解大豆蛋白补充晶体蛋氨酸饲料（ED-CMET），喂养初始体重为4.81±0.01g的星斑川鲽幼鱼56天，通过比较其生长、血液生化标、消化以及体组成等，来评价补充晶体蛋氨酸对星斑川鲽利用植物蛋白及其酶解物的效果。结果显示ED-CMET比ED分别提高幼鱼的末重4.7%、增重率7.9%和特定生长率4.6%，且显著提高星斑川鲽幼鱼的血细胞比容、血红蛋白含量、血清总蛋白水平以及高密度脂蛋白含量（P＜0.05），并且还增强了肝脏ATP酶活性，提高了全鱼的粗蛋白含量（P＜0.05）。而与SD饲料相比，在大豆浓缩蛋白饲料中添加蛋氨酸（SD-CMET）提高了高密度脂蛋白的含量，而对幼鱼其它指标无明显的影响（P＜0.05）。本实验结果说明在添加蛋氨酸无法改善星斑川鲽幼鱼利用大豆浓缩蛋白的效果，而酶解大豆蛋白中添加蛋氨酸能够提高星斑川鲽幼鱼的生长性能，且一定程度的提高机体的细胞免疫能力和肝脏代谢转运，调节血脂代谢，并可改善机体的营养组成。因此推荐在饲料中应用一定比例的酶解大豆蛋白，并在此基础上添加晶体蛋氨酸。

星斑川鲽；蛋氨酸；酶解大豆蛋白；生长；代谢；体组成

饵料中蛋白质营养价值的高低，很大程度上取决于所含的必需氨基酸和非必需氨基酸的数量和比例即氨基酸的平衡模式，只有饵料中各种氨基酸的数量与比例同鱼体的需要相接近时，才能满足鱼类对于蛋白质和氨基酸的需求，反之则会影响饵料中蛋白质的利用。相对于鱼粉含有高含量的蛋氨酸来说，植物蛋白源蛋氨酸含量较低，常常成为第一限制性氨基酸。基于蛋氨酸营养的重要性，在实际生产中，为了提高豆粕等植物性蛋白源的利用效率，往往考虑在饲料中添加蛋氨酸单体以解决植物性蛋白源氨基酸不平衡的问题。然而单体形式的蛋氨酸并不能被鱼类有效利用。其原因是由于晶体氨基酸与饲料中蛋白态氨基酸的吸收的不同步以及晶体氨基酸在水中的溶失。因此提高蛋氨酸的有效利用是解决植物蛋白高比例添加的关键之一。

相对于完整大豆蛋白，大豆蛋白酶解物的营养价值以及功能特性得到明显的改善，多元氮营养素形式（游离氨基酸、肽段以及部分消化蛋白）构成了多级消化吸收模式，能够提高动物消化吸收率，这种模式有利于鱼类充分利用蛋氨酸。在补充蛋氨酸的情况下，鱼类能够很好的利用酶解植物蛋白，如Song等（2014）在补充蛋氨酸的情况下发现大豆蛋白酶解物对星斑川鲽的生长作用好于全鱼粉饲料。相似的情况也在牙鲆上发现。本文通过在大豆浓缩蛋白及其酶解物所形成的饲料中补充单体形式的蛋氨酸，通过比较其生长性能、血液生化指标、消化能力以及体组成等方面的差异，来评价在补充蛋氨酸的情况下星斑川鲽幼鱼利用两种不同形式的植物蛋白的效果。

1　材料与方法

酶解大豆蛋白的制备参照Song等（2014）的方法制备，其中可溶解性氮采用Mamauaga等（2011）的方法测定为32%（22℃，pH7.5）。分别以大豆浓缩蛋白（购自山东长润生物有限公司，粗蛋白均为66.1%，粗脂肪为0.8%，粗灰分为5.2%）和酶解大豆蛋白，配合鱼粉（购自荣成海达鱼粉有限公司，粗蛋白为67.2%，粗脂肪为10.3%，粗灰分为15.7%）、花生粕（购自莘县鑫利农生物科技有限公司，粗蛋白为47.5%，粗脂肪为0.8%，粗灰分为5.9%）作为主要蛋白源配制4种等氮等能（粗蛋白水平为（45.32±0.17）%，能量水平为（20.08±0.08）kJ/g的实验饲料。鱼油和豆油按1∶1混合后加入1%的卵磷脂做为脂肪源，并调节其水平为12.05±0.14%。以α-淀粉和羧甲基纤维素来调节各组饲料成分平衡，配方见表1。其中ED为含有大豆蛋白酶解物的饲料，SD为含有大豆浓缩蛋白的饲料，ED-CMET和SD-CMET两种饲料是在ED和SD饲料的基础上添加0.5%晶体蛋氨酸形成。所有的原料充分混合，挤压制成直径3 mm的颗粒饲料，干燥至水分在8%以下，贮存在-20℃以备使用。实验饲料的原料及营养组成见表1。

表1　验饲料配方及营养组成（%）

1.2实验鱼及喂饲管理

星斑川鲽幼鱼购自市场，实验在山东省资源与环境研究院循环水养殖系统中进行，480尾幼鱼,初始体重（4.81±0.01）g随机分配到12个养殖塑料桶（400L）中，该循环系统带有冷凝和加热设备，可控制循环水系统内的问题。实验开始前，每组鱼用对照饲料驯化两周，使其适应整个环境条件和配合饲料。将4种饲料随机分配到12桶实验鱼中，每种饲料设3个平行，喂养试验持续8个周，每天投喂两次（07∶30和16∶00），每次目视鱼饱食后不再投喂。投饵20分钟后，收集残饵。在养殖期间，控制水温在（17.0±1.0）℃、盐度（32.0±1.2）‰、溶氧>5.0 mg L-1、NH4+-N<0.10 mg L-1。

1.3生长指标及形体指标测定

实验结束后，所有的鱼禁食24h后称量每桶鱼的总重，用于计算生长和饲料摄入。然后，每桶随机取15尾鱼，用MS-222麻醉，并且每尾鱼单独称重，测量体长和体宽。用注射器在鱼背部血管处取血。在4℃下，离心10 min（3000 g/min）以制备血清，贮存于-80℃用于生化指标分析。剖取肝脏、肠道、背部肌肉存放于-80℃下以备营养组成分析。生长指标的计算公式如下：

1.4血液生理生化指标测定

将注射器沿鱼体侧线部位斜向脊椎部分插入，抽出的血液加入生理盐水进行稀释，在血球计数板上立即计数。血细胞比容的测定采用温氏法，即取肝素钠抗凝静脉血2 mL，加入温氏管中，用水平离心机以2200×g离心30 min，离心后读取还原红细胞层柱高的毫米数，乘以0.01，即为每升血液中红细胞体积的升数。血红蛋白含量采用南京建成血红蛋白试剂盒测定。

谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血清总蛋白、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇等指标采用商品化试剂盒（北京利得曼生化股份有限公司，北京）所使用说明书中所指定的参数在全自动生化分析仪上测定（7020型，Hitachi，日本），血清尿素氮则是采用南京建成试剂盒进行测定。

1.5酶活性测定

Research on the Digital Development of the Intangible Cultural Heritage Tourism of Guilin Opera____________________________LI Guanghong,LIANG Minhua 28

消化酶和肝脏代谢酶的活性主要采用南京建成试剂盒进行测定。其中,（1）胃蛋白酶活性定义：在pH 2.0、37℃条件下，1g组织每分钟分解蛋白生成1μg氨基酸相当于1个酶活力单位，U/g prot。胰蛋白酶活性定义：在pH 8.0、37℃条件下，1μg蛋白中含有的胰蛋白酶每分钟使吸光度变化0.03为1个酶活力单位，U/μg prot。（2）脂肪酶活性定义：37℃条件下，1g组织在反应体系中与底物反应1min，每消耗1μmol底物为1个酶活力单位，U/g prot。（3）淀粉酶活性定义：37℃条件下，1g组织与底物作用30min，水解10mg淀粉定义为1个酶活力单位，U/g prot。（4）Na+-K+ATP酶活性定义：37℃条件下，每小时1mg组织蛋白中ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为1个酶活力单位。（5）碱性磷酸酶活性定义：定义为每1 g组织蛋白在37℃与基质作用15 min产生1 mg酚为1个酶活力单位，U/g prot。

1.6体组成分析

实验饲料、全鱼、肠道、肌肉等样品的干物质含量按照常压下105℃测定，蛋白采用FP-528燃烧测氮仪（Leco Corp.，Joseph，MI，USA），粗脂肪的测定采用索氏抽提法，能量测定采用Parr 6100型氧弹测能仪（Parr Instrument Co.，Moline，IL，USA）。

1.7统计分析

数据采用 SPSS16.0统计软件（SPSS Inc., Chicago,IL,USA）.）进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），当处理之间差异显著（P<0.05）时，用Duncan's检验进行多重比较分析。统计数据以平均值±标准差（Means±SD）形式表示。

2　结果与分析

2.1星斑川鲽生长性能及饲料利用实验过程中没有死亡发生（表2）。与SD饲料相比，SD-CMET饲料则对幼鱼生长性能和饵料利用各指标均无显著影响（P>0.05）。而ED-CMET分别则较ED饲料组提高幼鱼末重达4.7%、增重率7.9%和特定生长率4.6%（P<0.05），对摄食率和饵料系数无影响（P>0.05）。

表2　摄食不同实验饲料56天的星斑川鲽生长性能及饲料利用

2.2星斑川鲽幼鱼的血液学指标

表3　摄食不同实验饲料56天后的星斑川鲽幼鱼的血液生理生化指标

各饲料处理组幼鱼的血液学指标见表3。任何饲料处理对红细胞数、血清谷草转氨酶活性、谷丙转氨酶活性以及总胆固醇、甘油三脂和低密度脂蛋白含量无显著影响（P>0.05），但是ED-CMET饲料较ED饲料显著提高了星斑川鲽幼鱼的血细胞比容、血红蛋白含量、血清总蛋白水平以及高密度脂蛋白含量（P<0.05）。而与SD饲料相比，添加蛋氨酸（SD-CMET）提高了高密度脂蛋白含量（P<0.05），而对各项血清学指标并无明显改变（P>0.05）。

2.3星斑川鲽幼鱼胃肠道和肝脏酶活性

如表4所示，与ED饲料相比，ED-CMET对幼鱼胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、肠道碱性磷酸酶和ATP酶以及肝脏的谷丙转氨酶、谷草转氨酶和碱性磷酸酶无显著影响（P>0.05），但是显著提高了肝脏ATP酶活性（P<0.05）。而与SD饲料相比，SD-CMET饲料对幼鱼胃肠道和肝脏各种酶活均无显著影响（P>0.05）。

表4　摄食不同实验饲料56天后的星斑川鲽幼鱼的胃肠道和肝脏酶活性

2.4星斑川鲽幼鱼的体组织营养组成

摄食不同处理的饲料对幼鱼体组成有一定的影响（表5）。与ED饲料相比，ED-CMET饲料能显著提高全鱼的粗蛋白含量（P<0.05），而对其它指标无显著影响（P>0.05）。而SD和SD-CMET饲料组的实验鱼体组成并无明显差异（P>0.05）。

表5　摄食不同实验饲料56天后星斑川鲽幼鱼全鱼和肌肉的营养组成/%（干重）

3　讨论

本实验的结果表明在含有大豆浓缩蛋白的饲料中添加晶体氨基酸对星斑川鲽幼鱼的生长性能和饵料利用并无明显提高，这与在鲤鱼和大西洋鲑上的研究结果一致，而在大豆蛋白酶解物饲料中添加晶体蛋氨酸对星斑川鲽却能够显著提高鱼体的生长性能。这可能与动物体内存在一种氨基酸吸收的“内稳态”调节机制有关，在大豆浓缩蛋白饲料中直接添加的晶体蛋氨酸促使短时间在肠道内形成较高浓度的蛋氨酸，而此时大豆浓缩蛋白的消化还未达到高峰，导致晶体氨基酸与饲料中蛋白态氨基酸的吸收的不同步，从而激发细胞内稳态调节机制，将晶体氨基酸氧化为能量或者将其转化为其它物质消耗掉。同完整的大豆浓缩蛋白相比，大豆蛋白酶解物含有较多的部分消化蛋白、低分子量肽和游离氨基酸，小肽具有较高的吸收速度，且其通过专门的寡肽转运体进入体内，这样达到了与补充的氨基酸同步吸收，避免与补充的氨基酸竞争氨基酸载体，从而形成了一种平衡的吸收利用模式，提高机体蛋白的合成率，促进生长，提高饵料的利用效率。

蛋氨酸缺乏能导致动物机体血细胞免疫学指标的降低。Zhou等l（2006）也报道蛋氨酸水平不影响军曹鱼的红细胞数量，但却影响血细胞比容和血红蛋白含量。Ruchimat等（1997）报道摄食低蛋氨酸的饲料导致黄尾鰤的血细胞比容、血红蛋白含量以及红细胞数量均降低。蛋氨酸提高血红蛋白含量和血细胞比容的途径可能与在机体内的代谢作用有关，如蛋氨酸残基能够引发血细胞珠蛋白的α和β链的合成，而蛋氨酸的代谢产物-半胱氨酸能够促进细胞对微量元素铁的吸收。本实验中，在大豆浓缩蛋白饲料中添加晶体蛋氨酸对血细胞比容和血红蛋白含量并无影响，而在含有大豆蛋白酶解物的饲料中添加晶体蛋氨酸则提高了血细胞比容和血红蛋白含量，可能的原因是大豆蛋白酶解物能够和补充的蛋氨酸在肠道内形成平衡的氨基酸模式从而提高蛋氨酸的有效利用，且酶解物本身也能通过螯合铁离子，从而增强铁元素的吸收达到促进血红蛋白合成作用。另外，血清总蛋白也是肝脏功能的一项主要反映指标，其水平高低反应了肝脏的合成能力。饲料中的氮营养素质量和水平尤其是一些酶解物的添加，直接影响肝脏血清蛋白的合成能力。在本实验中也发现大豆蛋白酶解物添加晶体蛋氨酸均能增加血清蛋白的合成，说明加入了蛋氨酸提高了肝脏游离氨基酸库的平衡性，从而提高了肝脏合成能力，具体的作用机制有待于更为深入的研究。

饲料中蛋氨酸可调节动物体的脂肪代谢，这种调节作用主要通过提高脂蛋白酯酶的活性和胆汁酸的排泄、调节apo A-I和胆固醇7α-羟化酶的基因表达等实现。本实验中在含有大豆蛋白酶解物的饲料中添加晶体蛋氨酸明显并提高了高密度脂蛋白的水平，而在大豆浓缩蛋白的饲料中仅添加晶体蛋氨酸却无明显作用。以上现象说明利用酶解大豆蛋白能够提高鱼体对蛋氨酸的有效利用，从而达到调节血脂代谢的作用。而在酶解大豆蛋白中添加蛋氨酸能提高肝脏的ATP酶活性，这可能暗示幼鱼肝脏代谢转运活动有所提升，导致Na+-K+ATPase酶泵作用增强，肝细胞膜磷脂甲基化得到进一步提高，这可能与强化肝细胞内半胱氨酸、谷胱苷肽及牛磺酸的合成有关，具体原因需进行更为深入的实验研究。

有研究表明，在饲料中添加蛋氨酸能增加蛋白片段的合成速度和绝对量，而对降解速度没有影响，从而达到改善氮平衡，提高体蛋白合成速度的作用。本实验中，在含有大豆蛋白酶解物的饲料中添加晶体蛋氨酸提高了全鱼的粗蛋白水平，说明大豆蛋白酶解物在提升蛋氨酸的功效方面较大豆浓缩蛋白更有优势，可能的原因是大豆蛋白酶解物形成的多重氮营养素形式能够在消化过程中不断的与和蛋氨酸建立吸收代谢的平衡，从而能提高蛋白合成周转效率。

总之，大豆酶解蛋白在提高星斑川鲽幼鱼利用晶体蛋氨酸方面优于大豆浓缩蛋白，在含有大豆蛋白酶解物的饲料中添加蛋氨酸能提高星斑川鲽幼鱼的生长性能，且一定程度的提高机体的细胞免疫能力，提高肝脏代谢转运，调节血脂代谢，并可改善机体的营养组成。因此推荐在饲料中应添加一定比例的酶解大豆蛋白，并在此基础上添加晶体蛋氨酸。

［1］邓君明,麦康森,艾庆辉,等.不同氨基酸包被方法对牙鲆生长及血浆生化指标的影响 ［J］.动物营养学报,2007（06）∶706-713.

［2］侯瑶.大豆浓缩蛋白和分离蛋白限制酶解及功能性变化［D］.哈尔滨∶东北农业大学,2008.

［3］冷向军,罗运仙,李小勤,等.饲料中添加晶体或微囊氨基酸对鲤生长性能的影响 ［J］.动物营养学报,2010,22（6）∶1599-1606.

［4］梁鸿雁，高宏伟.单胃动物理想蛋白质与氨基酸模式的研究进展［J］.饲料博览，2010，5：8-10.

［5］林仕梅,麦康森,谭北平.实用饲料中添加结晶蛋氨酸对罗非鱼生长、体组成的影响［J］.水生生物学报,2008（05）∶741-749.

［6］骆军宁，加州鲈（Micropterus salmonoides）饲料中脱脂豆粕替代鱼粉的研究［D］.广州，中山大学，2006.

［7］钱爱萍，颜孙安，陆鹏，林香信，涂杰峰.无鱼粉蛋白饲料必需氨基酸平衡模式研究 ［J］.粮食与饲料工业，2012,6∶49-52.

［8］朱选,Lemme Andreas,高文,等.饲料中补充外源晶体DL-蛋氨酸对鲤科鱼类养殖的效用 ［J］.广东饲料,2011（12）∶18-23.

［9］Khalil R H,Saad T T,Derballa A E.Effect of lysine and methionine deficiency on immunity in fresh water fish［J］.Journal of the Arabian aquaculture society,2010,5（1）∶65-78.

［10］Mukhopadhyay N,Ray A K.Ffects of amino acid supplementation on the nutritive quality of fermented linseed meal protein in the diets of rohu,Labeo rohita,fingerlings［J］.J.Appl. Ichthyol,2001,17∶200-226.

［10］Opstvedt J,Aksnes A,Hope B,et al..Efficiency of feed utilization in Atlantic salmon（Salmo salar L.）fed diets with increasing substitution of fish meal with vegetable proteins［J］. Aquaculture,2003,221（1-4）∶365-379.

［11］Ostrowski H.The effects of dietary supplementation with lysine and methionine on body and tissue composition in the pig［J］.Animal Production,1969,11（04）∶521-532.

［12］Silk D B A,Chung Y C,Berger K L,Conley K,Beigler M,Sleisenger M H,Spiller G A,Kim Y S.Comparison of oral feeding of peptide and amino acid meals to normal human subjects［J］.Gut.1979,20（4）∶291-299.

［13］Takagi S,Shimeno S,Hosokawa H,et al..Effect of lysine and methionine supplementation to a soy protein concentrate diet for red sea bream Pagrus major［J］.Fisheries Science, 2001,67（6）∶1088-1096.

［14］Zhou Q,Wu Z,Tan B,et al..Optimal dietary methionine requirement for Juvenile Cobia（Rachycentron canadum）［J］. Aquaculture,2006,258（1-4）∶551-557.

S963.73

A

1005-8613（2016）09-0025-05

2016-7-22

烟台市科技发展计划项目（2013ZH348）。

宋志东（1978-），男，汉族，博士，水生动物营养与饲料

李培玉