基于计算机虚拟筛选技术的芹菜素靶标的预测*

崔明超,崔　文,陈少军,蔡　伟,江海龙,周海滨,凌庆枝△

(1.浙江医药高等专科学校中药学院，浙江宁波 315100；2.南京中医药大学药学院，南京 210023；3.青岛大学附属医院崂山院区，山东青岛266003；4.宁波立华制药有限公司，浙江宁波 315174)



·生物信息学·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.025

基于计算机虚拟筛选技术的芹菜素靶标的预测*

崔明超1,2,崔文3,陈少军1,蔡伟1,江海龙4,周海滨4,凌庆枝1△

(1.浙江医药高等专科学校中药学院，浙江宁波 315100；2.南京中医药大学药学院，南京 210023；3.青岛大学附属医院崂山院区，山东青岛266003；4.宁波立华制药有限公司，浙江宁波 315174)

目的利用计算机虚拟筛选技术对芹菜素的潜在靶标进行预测。方法采用PharmMapper网络服务器进行初步预测，利用PyRx0.8中的Autodock Vina模块进行分子对接，并结合文献挖掘进行验证，利用Discovery Studio 3.5 对靶蛋白-小分子复合物的相互作用模式进行分析。结果PharmMapper筛选显示芹菜素与胰岛素受体、17β-雌二醇脱氢酶1、组织蛋白酶K的结合较好；结合文献挖掘结果，发现胰岛素受体有相关实验研究，而其他2种则少见报道；利用分子对接技术分析芹菜素与靶蛋白核心氨基酸具有氢键、范德华力、静电作用力等相互作用。结论芹菜素的潜在靶标最有可能是胰岛素受体，而17β-雌二醇脱氢酶1和组织蛋白酶K也存在可能性。

芹菜素；受体，胰岛素；组织蛋白酶类；雌二醇脱氢酶类；靶标；虚拟筛选

芹菜素(apigenin，4′,5,7-trihydroxyflavone，C15H10O6)是一种广泛存在于水果、蔬菜、豆类、茶叶及多种中药中的天然黄酮类成分[1-2]。研究表明，芹菜素对多种肿瘤细胞的生长和增殖具有抑制作用[3]；具有抗氧化、抗炎、抗高血压、抗动脉硬化、抗血栓形成、抗焦虑、抗感染等多方面的作用[4]；而且较之槲皮素、山奈黄酮等其他黄酮类化合物其致畸变毒性更低[5]。计算机筛选是建立在理论计算-药物设计-化学合成-生物筛选有机结合的基础上，成功的筛选可以大大减少生物筛选的工作量，提高新药研发成功的概率[6-7]。本研究采用分子对接技术的原理是以小分子化合物为探针，在已知结构的靶标数据库中检索可能与之相结合的生物大分子，并通过能量匹配和空间的调整形成分子复合物，进而预测药物发挥作用的靶标[8]。近年来，有关芹菜素的药理活性研究日益广泛。然而，大多仍然处于简单的细胞实验和动物药效验证的阶段，其作用机制仍尚待进一步阐明。本文以芹菜素为研究对象，以PharmMapper作为靶标的筛选工具，并采用PyRx0.8中的Autodock Vina模块进行验证。

1　材料与方法

1.1PharmMapper对靶标的预测PharmMapper是2010年开发的一款免费的网络服务器，基于Targetbank、Drugbank、bindDB、和PDTD四大数据库利用药效团匹配法，使其预测结果更加可靠[9]。通常从植物、动物或菌物中分离得到的天然产物会具有抗氧化、抗菌、抗炎等多种作用，但是需要大量的生物实验加以验证或者排除，费时费力；另一方面，某些已经上市销售多年的药物，因为对其分子靶标的认识程度不够，而没有认识到它的其他不良反应或者新作用。如传统用来治疗高脂血症的他汀类药物，近年来发现同时具有抗肿瘤的作用，其机制仍在进一步研究之中[10]。因此采用计算机虚拟筛选技术对天然产物进行研究十分有必要。

1.2分子对接验证从靶蛋白数据库(PDB，http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)下载靶蛋白的三维结构，然后采用蛋白质预处理工具(Protein Preparing Tool，http://dock.cmu.edu.tw/ligand.php)对靶蛋白进行预处理，提供配体的坐标、结合位置、半径信息，并提供质子化的靶蛋白文件等。芹菜素与疾病相关的靶蛋白采用PyRx0.8软件的Autodock Vina模块进行分子对接，Autodock Vina较之具有运算速度更快，精度更高的优点，是目前最常用的对接软件之一[11]。对接结果用分子模拟图形界面软件Discovery Studio Visualizer 3.5进行处理。

表1　PharmMapper筛选出的芹菜素与疾病相关的潜在靶标

1.3评价方法反向对接结果利用PharmMapper的打分函数给出的结果fit score作为判断依据。正向分子对接采用复合体中配体和受体蛋白之间的相互作用力作为判断标准。

2　结　果

2.1基于PharmMapper的虚拟筛选利用PharmMapper对其数据库的7 000余种靶蛋白进行对接，结果按照fit score的从大到小进行排序，数值越大，则其结合越容易。其结果见表1(表中略去与疾病无关的靶蛋白)。另外还可以观察到配体与各个靶蛋白的药效团匹配情况，见图1、表2。

A胰岛素受体；B 17β-雌二醇脱氢酶1；C组织蛋白酶K。

图1　芹菜素与靶蛋白药效团叠合图

2.2文献挖掘通过文献检索中国知网和Pubmed数据库，发现芹菜素对Estradiol 17-beta-dehydrogenase 1、Cathepsin的研究少见报道，而对胰岛素受体有相关报道。Basta-Kaim等[12]研究发现芹菜素可以通过抑制IGF/IGF-IR和PI3K/Akt信号通路而发挥抑制前列腺癌细胞增殖，诱导细胞凋亡的作用。因此从数据挖掘情况分析，故胰岛素受体极有可能是芹菜素重要的作用靶标，而17β-雌二醇脱氢酶1、组织蛋白酶K有进一步研究价值。

2.3基于PyRx的分子对接验证在上述筛选的基础上，对潜在的靶标分子利用PyRx0.8软件中的auto vina模块中与芹菜素进行分子对接，并对复合体进行分析。在对接过程中，以靶蛋白自带的配体位置为参照，其坐标参考蛋白质预处理工具Protein Preparing Tool提供的活性结合点，见表3。

完成分子对接后，用DSV3.5分析靶蛋白与配体形成的复合物之间的相互作用情况。芹菜素结合于胰岛素受体(1I44)的活性口袋之中，两者之间存在着氢键作用(THR A:1145),Pi-Pi相互作用力(PHE A：1144)，范德华力作用(PRO A:1104等)，静电作用力(MET A:1112,GLN A:1111等若干氨基酸)等多种作用力，见图2。

芹菜素结合于17β-雌二醇脱氢酶1(1I5R)的活性口袋之中，两者之间存在着氢键作用(ASN A:152),Pi-Pi相互作用力(PHE A：226)，范德华力作用(GLU A:194等)，静电作用力(LEU A:95,PHE A:192等)等多种作用力，见图3。

表3　分子对接结合位点与对接能

图2　芹菜素与胰岛素受体相互作用示意图

图3　芹菜素与17β-雌二醇脱氢酶1相互作用示意图

芹菜素结合于组织蛋白酶K(1TU6)的A链的活性口袋之中，两者之间存在着氢键作用(GLU A:173),范德华力作用(ASN A:192等)，静电作用力(SER A:172等)等多种作用力(图4A)。芹菜素结合于组织蛋白酶K(1TU6)的B链的活性口袋之中，两者之间存在着Pi-Pi相互作用力(TRP B：298)，范德华力作用(GLN B:133等)，静电作用力(TRP B:302等)等多种作用力，见图4B。

A：与A链；B：与B链。

图4芹菜素与组织蛋白酶K相互作用示意图

3　讨　论

作者利用计算机虚拟筛选技术对芹菜素的潜在靶标进行了预测。首先采用PharmMapper网络服务器进行初步预测，对其数据库的7 000余种靶蛋白进行对接，排除掉目前研究尚无相关疾病的靶蛋白，剩余3种靶蛋白，胰岛素受体(insulin receptor)、17β-雌二醇脱氢酶1 (Estradiol 17-beta-dehydrogenase 1)和组织蛋白酶K(Cathepsin K)。同时，系统还给出了配体与各个靶蛋白的药效团匹配情况。

然后，采用数据挖掘的方法，从数据库(中国知网和Pubmed数据库)中检索发现目前芹菜素对Estradiol 17-beta-dehydrogenase 1，Cathepsin K的研究少见报道，但对胰岛素受体相关的研究有报道。

因各软件的计算方法不同，多种软件的使用有利于提高其准确率。对接结果利用PyRx0.8中的Autodock Vina模块进行验证，利用Discovery Studio 3.5对靶蛋白-小分子复合物的相互作用模式进行分析。结果表明，胰岛素受体最有可能是芹菜素的潜在靶标，而17β-雌二醇脱氢酶1和组织蛋白酶K也有可能是其潜在靶标。

虚拟筛选中药物的阳性率一般为5%～20%[13]，易出现假阳性的结果，需要有相关的实验来验证。

目前，胰岛素受体与配体结合形成复合体的机制，以及受体激活机制等最基本问题还需要深入研究[14]。位点突变扫描实验研究发现，其潜在位点是位于配体分子表面和疏水核心的特定的残基[15-16]，本文的分子对接也验证了这一点。

通过虚拟筛选出来的作用靶点，可以为后续研究提供可能的作用途径，指明研究方向。由计算机模拟得到结果仍需要进一步的实验验证。本文为芹菜素的靶标研究、药理活性与临床应用研究提供了理论支撑。

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Potential targets prediction of apigenin via virtual screening*

Cui Mingchao1,2,Cui Wen3,Chen Shaojun1,Cai Wei1,Jiang Hailong4,Zhou Haibin4,Ling Qingzhi1△

(1.DepartmentofTCM,ZhejiangPharmaceuticalCollege,Ningbo,Zhejiang315100,China;2.CollegeofPharmacy,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing,Jiangsu210023,China;3.LaoshanDistrict,theAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao,Shandong266003,China;4.NingboLiwahPharmaceuticalCo.Ltd.,Ningbo,Zhejiang315174,China)

ObjectiveTo predict the potential targets of apigenin by virtual screening.MethodsThe targets preliminarily forecast by PharmMapper,were validated by associating data mining and Autodock Vina in PyRx 0.8.Subsequently,receptor-ligand interactions were analyzed by Discovery Studio 3.5.ResultsThe virtual screening by PharmMapper indicated that apigenin coupled well with the disease-related targets including insulin receptor,estradiol 17-beta-dehydrogenase 1,and cathepsin K.According to the data mining,insulin receptor was found in related experimental researches,while the other two had few reports previously.And then,the interactions between apigenin and the target proteins were analyzed by Autodock Vina and Discovery Studio Visualizer 3.5,involving hydrogen bonds,electrostatic forces,van der Waals forces etc.ConclusionThe most potential targets of apigenin were insulin receptor,while 17-beta-dehydrogenase 1 and cathepsin K were also possible.

apigenin;receptor,insulin;cathepsins;estradiol dehydrogenases;targets;virtual screening

浙江省自然科学基金资助项目(LY15H280009);浙江省宁波市自然基金资助项目(2015A610290);鄞州区农业与社会发展科技项目(鄞科[2015]69号)。作者简介：崔明超(1983-)，讲师，硕士，主要从事中药资源与新药研发的工作。△

，E-mail:lingqingzhi@sina.com。

R285.5

A

1671-8348(2016)27-3821-03

2016-02-18

2016-04-06)