野生酸枣仁中总黄酮的提取及其抗氧化活性

蔡雨晴　贾棹东　吴茜茜　蒋 卉*

(1 南疆化工重点实验室/生命科学学院， 新疆 阿拉尔 843300)(2 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物质源保护利用重点实验室/生命科学学院， 新疆 阿拉尔 843300)



野生酸枣仁中总黄酮的提取及其抗氧化活性

蔡雨晴1,2贾棹东1吴茜茜1蒋 卉1,2*

(1 南疆化工重点实验室/生命科学学院， 新疆 阿拉尔 843300)(2 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物质源保护利用重点实验室/生命科学学院， 新疆 阿拉尔 843300)

【目的】试验以酸枣仁为试验材料，采用超声波辅助提取酸枣仁中的总黄酮，研究其抗氧化活性。【方法】通过单因素试验考察了乙醇浓度、浸泡时间、超声温度、超声时间、料液比对酸枣仁总黄酮提取率的影响以及提取物的活性。【结果】按照单因素试验确定参数变化水平区间，得到酸枣仁总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度64. 46%，浸泡时间12 h，超声时间44. 02 min，超声温度62. 86 ℃，总黄酮提取含量为7. 415 2 mg/g。抗氧化试验结果表明，酸枣仁黄酮清除DPPH、羟自由基的IC50值分别为0. 436 mg/mL和2. 505 1 mg/mL。【结论】优化了酸枣仁中总黄酮的提取方法，黄酮粗提物具有一定的清除自由基活性。

酸枣仁； 总黄酮； 超声波辅助提取； 抗氧化活性

酸枣仁是鼠李科(Rhamnaceae)植物酸枣(Zizyphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H. F. Chow)的种子，具有养心补肝、宁心安神等功效，是较为常用的镇定安眠的中药，是卫生部认定的药食同源的物品之一[1-2]。酸枣仁中主要的化学成分有黄酮[3-6]、生物碱[7-8]、皂苷[9-11]、三萜[12]等化合物。牛春燕，李游[13-14]等认为黄酮类物质为酸枣仁主要有效成分之一。本文对酸枣仁中黄酮的提取工艺进行优化，并对提取的黄酮进行了抗氧化实验。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

野生酸枣仁：2014年11月采集于陕西省渭南市澄城县交道镇阿兰寨村边山上，经塔里木大学植物科学学院吴翠云教授鉴定为鼠李科(Rhamnaceae)植物酸枣(Zizyphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H. F. Chow)的种子。

芦丁标准品(纯度>98%)；石油醚、乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、邻二氮菲、硫酸亚铁、过氧化氢均为分析纯；

DHG-9145A电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；LD500摇摆式中药粉碎机(长沙市岳麓区常宏制药机械设备厂)；Sartorius-SQP电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；721-100紫外—可见分光光度计(上海菁华科技有限公司)；RE-50B旋转蒸发器(上海申生科技有限公司)；仪表恒温水浴锅(上海申光仪器仪表有限公)；KQ3200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；800型离心沉淀器(上海手术器械厂)。

1.2试验方法

1.2.1原料预处理

酸枣仁脱脂粉的制备：将酸枣仁粉碎，过20目筛，称取一定量的酸枣仁粉置于索氏提取器中，用10倍体积的石油醚(60～90 ℃)水浴回流脱脂2次，每次回流3 h，并回收石油醚。将脱脂后的酸枣仁粉混匀后密封干燥保存。

1.2.2酸枣仁总黄酮含量的测定

1.2.2.1标准曲线的制作

芦丁标准品溶液的制备：精密称取芦丁标准品12. 00 mg置于10. 0 mL容量瓶中，用乙醇超声溶解，定容，即浓度为1. 200 mg/mL芦丁溶液作为标准品母液。

采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法绘制芦丁标准曲线[15]，溶液为空白对照，于波长510 nm测其吸光度。以芦丁标准液浓度(mg/mL)为横坐标(X)，吸光度(A)为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。

1.2.2.2样品中总黄酮提取率的测定

供试样品溶液的制备：精确称取2. 000 g酸枣仁粉，以乙醇浓度为20%，料液比为1:10，浸泡时间为12 h，在超声功率为150 W，超声温度为40 ℃的条件下超声提取30 min，提取液以3 000 r/min转速离心20 min，即得供试样品溶液。

取5. 0 mL供试样品溶液于50. 00 mL容量瓶中，按测定芦丁标准溶液吸光度的方法测定样品溶液的吸光度，计算总黄酮的提取率。酸枣仁总黄酮提取率的计算公式为：

总黄酮平均含量(Q)=C×V×D/M；

总黄酮提取率/%=C×V×D×100/(M×Q)式中：C为总黄酮提取液的质量浓度(mg/mL)；V为溶液体积(mL)；D为溶液稀释倍数；M为酸枣仁的质量(g)。

1.2.3超声波辅助提取总黄酮单因素试验设计

精确称取酸枣仁粉2. 000 g，选择乙醇浓度0、20、40、60、80、100%，超声时间10、20、30、40、50、60 min，超声温度30、40、50、60、70、80 ℃，浸泡时间4、8、12、16、20、24 h，料液比1：5、1：10、1：15、1：20、1：25、1：30，5个参试因子进行单因素试验，考察各个因素对酸枣仁总黄酮提取率的影响。

1.2.4酸枣仁总黄酮的抗氧化性试验

样品溶液的制备：称取12. 0 g脱脂酸枣仁粉末，以最优条件提取，离心，将得到的上清液浓缩，干燥，得到1. 646 g酸枣仁黄酮粗提物。

称取0. 050 g粗提物于10. 0 mL的容量瓶中，加水溶解并定容，此样品粗提物溶液浓度为5. 00 mg/mL，即1.0 mL相当于样品中含有5. 0 mg粗提物，(1. 0 mL粗提物相当于芦丁0. 041 5 mg)。将上述溶液配制成不同浓度的溶液0. 05、0. 1、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8 mg/mL，上述溶液做清除羟自由基和还原力的测定，芦丁含量分别为0. 004 15、0. 008 3、0. 016 6、0. 033 2、0. 049 8、0. 066 4 mg。

1.2.5.1酸枣仁总黄酮还原力的测定

将酸枣仁黄酮粗提物稀释成不同的浓度梯度，各取1. 0 mL不同浓度样品于试管中，分别加入1. 5 mL0. 200 mol/L的PH为6. 6的磷酸盐缓冲溶液和1. 5 mL1%铁氰化钾溶液，混合均匀，50 ℃水浴20 min，急速冷却，再加入1. 5 mL10%的三氯乙酸溶液，于2000 r/min离心15 min，取上清液3. 0 mL，再加入3. 0 mL蒸馏水和0. 5 mL0.1%的三氯化铁溶液，混匀，静置10 min，于700 nm处测定吸光度。每组试验平行操作3次。并以芦丁标准品按照上述相同步骤操作，做阳性对照组。1.2.5.2酸枣仁总黄酮对DPPH自由基清除率的测定

精密移取2. 0 mL不同浓度的酸枣仁黄酮样品于试管中，加入2. 0 mL0. 200 mmol/L的DPPH溶液，混合均匀，室温下暗处理20 min，以无水乙醇为参比，在517 nm处测定吸光度Ai；量取2. 0 mL不同浓度的样品溶液于试管中，加入2. 0 mL蒸馏水，混合均匀，室温下暗处理20 min，于517 nm处测定吸光度Aj；取2. 0 mL0. 20 mmol/L的DPPH溶液，加入2. 0 mL蒸馏水，混合均匀，室温下暗处理20 min，于517 nm处测定吸光度A。每组试验平行操作3次。并以芦丁标准品按照上述相同步骤操作，做阳性对照组，分别计算清除率。

DPPH清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A]*100

1.2.5.3酸枣仁总黄酮对羟自由基清除能力的测定

精密移取1. 0 mL1. 500 mmol/L邻二氮菲溶液于试管中，依次加入2. 0 mL0. 200 mol/L的PH为7. 4的磷酸盐缓冲溶液和1. 0 mL样品溶液，充分混匀，再加1. 0 mL1. 500 mmol/L硫酸亚铁溶液，混匀，加1. 0 mL0.10%过氧化氢溶液，混合均匀，置于38 ℃水浴锅中保温1 h，于536 nm处测定吸光度AS；用1.0 mL去离子水代替1. 0 mL过氧化氢溶液，测定吸光度Ab。每组试验平行操作3次。并以芦丁标准品按照上述相同步骤操作，做阳性对照组，分别计算清除率。

OH清除率(%)=AS/Ab*100

2　结果与分析

2.1芦丁标准曲线的绘制

标准曲线如图1所示。在0. 06～3. 00 mg/mL浓度范围内，吸光度(A)与标准品浓度(mg/mL)线性关系良好。

图1　芦丁标准曲线

图2　乙醇浓度对酸枣仁总黄酮提取率的影响

2.2单因素试验结果分析

在固定超声功率为150 W的条件下，采用单因素试验方法研究乙醇浓度、料液比、浸泡时间、超声温度和超声时间对酸枣仁黄酮含量的影响，试验结果见图2～6。

图3　料液比对酸枣仁总黄酮提取率的影响

图4　浸泡时间对酸枣仁总黄酮提取率的影响

图5　超声温度对酸枣仁总黄酮提取率的影响

图6　超声时间对酸枣仁总黄酮提取率的影响

由图2～图6可知，当乙醇浓度达到60%提取量达到峰值，随着乙醇浓度的增大提取量逐渐下降，当浸泡时间达到12 h时，提取量达到峰值，随着浸泡时间的增大提取量逐渐下降，因此确定浸泡时间12 h为最佳条件；当超声时间达到40 min时，提取量达到峰值，随着超声时间的增大提取量逐渐下降，因此确定超声时间40 min为最佳条件；当超声温度达到60 ℃时，提取量达到峰值，随着超声温度的增大提取量下降，因此确定超声温度60 ℃为最佳条件。由以上单因素试验结果得到酸枣仁黄酮适宜的提取条件是：乙醇浓度为60%，料液比1:25，浸泡时间12 h，超声功率150 W，超声温度为60 ℃，超声时间为40 min。

2.3酸枣仁总黄酮抗氧化性的测定结果与分析

2.3.1还原力测定结果

酸枣仁总黄酮和芦丁标准品还原力测定结果见图7。由图7可以看出，酸枣仁黄酮具有一定的还原力，且芦丁和酸枣仁黄酮的还原力都随着溶液浓度的升高而增大。抗氧化活性与还原力之间普遍存在相关性，可通过测定还原力来表示抗氧化活性强弱，吸光度越高，还原能力越强。在0. 05～0. 80 mg/mL范围内，芦丁具有较强的还原能力，芦丁的还原能力明显强于酸枣仁黄酮的还原能力。

图7　酸枣仁总黄酮和芦丁还原力测定结果

2.3.2DPPH清除率的测定结果

图8　酸枣仁总黄酮和芦丁DPPH·清除率测定结果

由图8可知，酸枣仁黄酮对DPPH具有一定的清除能力，且随浓度的增大而增强。在0. 05～0. 50 mg/mL浓度范围内服从线性分布，y=111. 17x+1. 532 6，R2=0. 992 5，根据线性方程，可得到酸枣仁黄酮的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration of a substance，IC50)，即清除率为50%需要样品浓度为0. 436 mg/mL。根据线性方程y=20. 974In(x)+107. 26，R2=0. 974 0，得到芦丁的IC50值为0. 0636 mg/mL。酸枣仁黄酮具有较强清除DPPH能力，但弱于芦丁清除DPPH的能力，这是由于酸枣仁黄酮提取物为混合物，纯度低，杂质比较多，影响其活性。一般认为某种物质的IC50值低于10. 0 mg/mL，表明其具有较好的抗氧化性[17]。

图9　酸枣仁总黄酮和芦丁对羟自由基清除率测定结果

由图9可知，随着酸枣仁黄酮提取物浓度的增大，提取物对羟自由基的清除能力增强。在0. 05～0. 80 mg/mL浓度范围内服从线性分布，y=9. 506 6x+26. 185，R2=0. 967 7，根据线性方程，可得到IC50值为2. 505 1 mg/mL。根据线性方程y=21.731In(x)+93. 544，R2=0. 931 1，得到芦丁的IC50值为0. 134 8 mg/mL，说明酸枣仁黄酮提取物具有清除羟自由基的能力，但明显弱于芦丁。

3　结论

本实验以脱脂后的酸枣仁为实验材料，采用超声波辅助提取工艺，根据单因素试验结果，建立了乙醇浓度、浸泡时间、超声温度、超声时间对酸枣仁总黄酮提取率的回归模型，能够比较好的预测酸枣仁总黄酮的提取率。得到超声波辅助提取酸枣仁总黄酮的最佳工艺为：乙醇浓度64.46%，浸泡时间12 h，超声温度62. 86 ℃，超声时间44. 02 min，在此工艺条件下酸枣仁总黄酮理论提取含量为8. 078 7 mg/g，实际总黄酮提取含量为7. 415 2 mg/g。

酸枣仁总黄酮和芦丁的还原能力、清除DPPH、清除OH·都随着溶液浓度的增大而增强，酸枣仁黄酮和芦丁清除DPPH的IC50值分别为0. 436 mg/mL和0. 063 6 mg/mL，清除OH·的IC50值分别为2. 505 1 mg/mL和0. 134 8 mg/mL，说明酸枣仁黄酮具有一定的抗氧化活性，但芦丁的还原力、清除DPPH、清除OH·的能力均强于酸枣仁黄酮，这是由于酸枣仁黄酮是粗提取物，抗氧化活性成分含量比较低，其他杂质的存在影响其抗氧化活性。

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Extraction and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Zizyphi spinosi Semen

Cai Yuqing1,2Jia Zhuodong1Wu Xixi1Jiang Hui1,2*

(1 Key Laboratory of Chemical Engineering in South Xinjiang/ College of Life Sciences, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300) ( 2 Key Laboratory of Protection & Utilization of Biological Resources in Tarim Basin of Xinjiang Production and Construction Corps/ College of Life Sciences, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300)

【Objective】 Taking Zizyphi spinosi Semen as the test material, by using ultrasonic assisted extraction, the optimized extraction method of total flavonoids in Zizyphi spinosi Semen, and its antioxidant activity were studied. 【Methods】 A single factor test to determine the effects of ethanol concentration, time, ultrasonic temperature, ultrasonic time, solid-liquid ratio on the extraction rate and extract activity. 【Results】 According to the single factor test, the parameters ranges were determined, and were as follows: 64.46% ethanol concentration, 12 hours immersion, 44.02 min for ultrasonic and ultrasonic temperature of 62.86 °C. The anti-oxidation experiment showed that, the IC50values of Zizyphi spinosi Semen for clearance of DPPH and hydroxyl radicals were 0.4360mg / mL and 2.5051mg / mL respectively. 【Conclusion】 The extraction method of total flavones of Semen Ziziphi spinosa was optimized. And the total flavones exhibited radical scavenging activity under the experimental conditons.

Semen Zizyphi spinosi; total flavonoids; ultrasonic-assisted; antioxidant activity

2015-08-04

国家大学生创新创业训练计划项目(201410757011)。

蔡雨晴(1992-)，女，2015级在读硕士，研究方向为植物资源保护利用。E-mail：caicaiyuqing@126.com

�E-mail：jh1156@163.com

1009-0568(2016)03-0046-06

S816.7

ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2016.03.009