不同杂交家系铁皮石斛花多糖、浸出物及氨基酸质量分数分析

吕素华，徐　萌，张新凤，刘京晶，斯金平

（浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 临安 311300）

不同杂交家系铁皮石斛花多糖、浸出物及氨基酸质量分数分析

吕素华，徐萌，张新凤，刘京晶，斯金平

（浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 临安 311300）

铁皮石斛Dendrobium officinale花是铁皮石斛药材的非药用部位，为测定其多糖、浸出物、氨基酸的质量分数，探讨3种成分之间的内在关系，全面了解铁皮石斛花中的物质分布规律，利用药典方法测定铁皮石斛花的多糖、浸出物质量分数，并采用17种氨基酸标准品，通过酸水解法提取、异硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生处理样品，结合反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定10个不同杂交家系铁皮石斛花中的氨基酸组成与质量分数。结果表明：铁皮石斛花中多糖质量分数平均为71.00 mg·g-1，浸出物质量分数为300.00 mg·g-1；从铁皮石斛花中检测到16种氨基酸，总氨基酸平均质量分数为7.88%；3种成分质量分数差异显著（P＜0.05）。利用SPSS 17.0分析3种成分之间的相关性，多糖和浸出物在合成积累上呈现负相关，与氨基酸之间相关性不明显（P＞0.05）。铁皮石斛花中含有较丰富的多糖、浸出物及氨基酸等营养及功效成分，具有一定的保健开发价值。图1表3参11

中草药学；铁皮石斛花；氨基酸；多糖；浸出物；相关性

铁皮石斛Dendrobium officinale主要以茎入药，其质量主要以多糖、浸出物含量作为评价依据［1］。铁皮石斛花虽是非药用部位，但在栽培生产中产量较大，民间多用来制作花茶，已有报道其含有黄酮类［2］、多糖［3］、氨基酸［4］等成分。本课题组在铁皮石斛杂交选育中发现：不同来源的铁皮石斛亲本杂交出来的子代鲜花在外观、气味、颜色等方面表现差异较大，但关于铁皮石斛杂交家系鲜花在多糖、醇溶性成分、氨基酸等成分上的分布规律及质量分数还未见报道。本试验采集不同杂交家系铁皮石斛鲜花，参照药典方法测定多糖及浸出物质量分数，并以17种氨基酸为标准，采用异硫氰酸苯酯（PITC）进行柱前衍生［5-6］，结合反相高效液相色谱法（RP-HPLC）［7］分析铁皮石斛花中氨基酸质量分数，探讨多糖、浸出物和氨基酸等成分之间的相关性，比较样本之间的品质差异，揭示铁皮石斛花中主要营养及功效成分的分布及比例，对铁皮石斛花的品质研究及资源开发利用具有重要的理论意义。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

AB104-N电子分析天平（中国梅特勒托利多仪器上海有限公司）；DK-S24型电热恒温水浴锅（中国上海森信实验仪器有限公司）；D-37520型高速离心机（德国 Heraeus公司）；GENESYS 10S UV-Vis紫外分光光度仪；DHG-9070HA精密性强制对流干燥箱（中国杭州蓝天化验仪器厂）； Agilent 1200高效液相色谱系统（美国Agilent公司，含四元梯度泵、自动进样器、二极管阵列检测器）。

安捷伦氨基酸分析柱，17种氨基酸混合标准溶液：天冬氨酸（Asp），谷氨酸（Glu），丝氨酸（Ser），甘氨酸（Gly），组氨酸（His），精氨酸（Arg），苏氨酸（Thr），丙氨酸（Ala），脯氨酸（Pro），酪氨酸（Tyr），缬氨酸（Val），蛋氨酸（Met），胱氨酸（Cys），异亮氨酸（Ile），亮氨酸（Leu），苯丙氨酸（Phe），赖氨酸（Lys），购自中国天津博纳艾杰尔公司。

葡萄糖标准品（购自中国药品生物制品鉴定所，110833-200904）；重蒸酚（中国北京索莱宝科技有限公司）；其他试剂均为分析醇，水为自制蒸馏水。

1.2供试样品

供试样品10个杂交家系铁皮石斛亲本来自于中国主要分布区内［8-9］，所有杂交子代鲜花均于2014 年5月12号采自浙江省义乌丹溪药博园，杂交家系有1×6，80×27，6A×2B，78×69，9×66，森山1号，83×34，80×56，17×30，68×72。采集的铁皮石斛花样品均于65℃烘箱中烘干，粉碎，过60目筛，干燥器中保存备用。

1.3方法

1.3.1多糖质量分数测定方法参照《中华人民共和国药典：2010年版一部》，精密称量不同家系铁皮石斛花粉末各0.30 g，加入200.00 mL蒸馏水2.00 h回流提取，过滤定容至250.00 mL。移液管精密量取5.00 mL于50.00 mL离心管中，加25.00 mL无水乙醇，4℃冰箱静置1.00 h后，4 000 r·min-1离心20.00 min，弃上清液加入体积分数为80.00%乙醇20.00 mL离心20.00 min，重复2次，弃上清液，沉淀加水助溶，定容至50.00 mL。加1.00 mL样品溶液于试管中，冰水中加体积分数5.00%苯酚1.00 mL，混匀后加入5.00 mL浓硫酸，充分混匀，冰水中静置5.00 min，沸水浴20.00 min，取出在冰水中放凉，于488.00 nm处测定吸光度，试验平行3次。以葡萄糖标品制作标准曲线，回归方程为y=8.717 1x+ 0.014 7，R2=0.999，其中y为吸收度，x为质量浓度。

1.3.2浸出物质量分数测定方法参照《中华人民共和国药典：2010年版一部》附录ⅤA项下热浸法测定，以体积分数为95.00%无水乙醇做溶剂。精密称定供试样品2.00 g，置于100.00 mL具塞圆底烧瓶中，精密加乙醇50.00 mL，密塞称定质量静置1.00 h，85℃水浴回流微沸1.00 h，放冷取下密塞并补足差质量，摇匀过滤，移液管精密量取25.00 mL，置于干燥至恒量的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃烘箱干燥3.00 h，干燥器冷却30.00 min，迅速精密称定质量，以干燥品计算供试品中醇溶性浸出物的质量（%），试验平行3次。

1.3.3氨基酸质量分数测定方法①标准溶液及试剂配制。标准溶液：氨基酸混合标准溶液除胱氨酸浓度为1.25 mmol·L-1，其余16种氨基酸浓度均为2.50 mmol·L-1，置于冰箱中备用，使用前室温放置30.00 min。异硫氰酸苯酯乙腈溶液：准确移取25.00 μL一流氰酸苯酯溶液与2.00 mL乙腈混匀。三乙胺乙腈溶液：准确移取1.40 mL三乙胺，乙腈定容至10.00 mL容量瓶中。正亮氨酸内标溶液：精确称取正亮氨酸10.00 mg，加0.10 mol·L-1盐酸溶液10.00 mL溶解，混匀。流动相A（乙酸钠缓冲盐溶液）：精密称取15.20 g无水乙酸钠，去离子水1 850.00 mL，溶解后冰醋酸调pH 6.50，然后加乙腈140.00 mL，混匀，0.45 μm滤膜过滤，超声30.00 min备用；流动相B：体积分数为80.00%乙腈水溶液。②色谱条件。Venusil AA氨基酸分析柱（4.60 mm×250 mm，5.00 μm），流动相：A，B柱温40.00℃，进样量10.00 μL，波长254 nm，流速1.00 mL·min-1。流动相梯度（B）：0～2.00 min，0.00%～0.00%；2.00～15.00 min，0.00%～10.00%；15.00～25.00 min，10.00%～30.00%；25.00～33.00 min，30.00%～45.00%；33.00～33.10 min，45.00%～100.00%；33.10～38.00 min，100.00%～100.00%；38.00～38.10 min，100.00%～0.00%；38.10～45.00 min，0.00%～0.00%。③样品水解液制备。参照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》。精密称取铁皮石斛花样品各0.20 g，精确到0.000 1 g，置于20.00 mL水解管中，加10.00 mL含体积分数为0.10%苯酚的6.00 mol·L-1盐酸，振摇使样品均匀分散于溶液中，-20.00℃冰箱冷冻3.00～5.00 min，N2封管。（105.00±1.00）℃烘箱中水解24.00 h，取出冷却至室温。水解液1.00 mL，浓缩至干后加1.00 mL浓度为0.10 mol·L-1盐酸助溶，0.45 μm微孔滤膜过滤后储于冰箱，衍生备用。④铁皮石斛花水解液HPLC柱前衍生。1.50 mL离心管中分别准确吸取氨基酸标准溶液及样品200.00 μL，加入正亮氨酸内标溶液20.00 μL，三乙胺乙腈溶液100.00 μL，异硫氰酸苯酯乙腈溶液100.00 μL，混匀，室温静置1.00 h。加入正己烷400.00 μL，振摇后放置10.00 min，取下层溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤，待测。样品溶液中各种氨基酸质量浓度（mg·L-1）=f1/f2×c。其中：f1为样品溶液中各氨基酸峰面积/内标峰面积；f2为混合氨基酸标准溶液中各氨基酸峰面积/内标峰面积。c为氨基酸对照品质量浓度（mg·L-1）。⑤氨基酸数据分析。利用方差分析比较不同家系铁皮石斛花各氨基酸含量的差异，使用SIMCA-P统计软件（Version 11.0，Umea，瑞典）进行偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）。该分析方法可提供变量重要性投影参数（VIP）定量估计每个单元的区分能力，VIP值可根据自己区分不同类别的能力对描述对象进行分类［10］。以不同氨基酸含量为变量进行偏最小二乘法判别分析（PLS-DA），分析不同家系之间氨基酸含量的差异。

2　结果与分析

2.1铁皮石斛花多糖、浸出物质量分数

利用苯酚-硫酸法和热浸法分别对不同品系铁皮石斛花中多糖和浸出物质量分数进行测定，结果如表1所示。《中华人民共和国药典：2010年版一部》中规定铁皮石斛茎多糖质量分数不得低于250.00 mg· g-1，醇溶性浸出物不得低于65.00 g·kg-1（6.50%）。本试验测定铁皮石斛花中多糖约为71.00 mg·g-1，比茎中要低；花中浸出物平均约为300.00 mg·g-1，远远高于药典标准，说明其含有丰富的次生代谢物质。由表1可以看出：不同家系间铁皮石斛花多糖、浸出物差异显著，其中68×72，6A×2B，78×69和森山1号4个家系铁皮石斛花多糖质量分数显著高于其他家系，1×6，80×27，9×66和83×34浸出物质量分数显著高于其他家系。

表1　不同杂交家系铁皮石斛花中多糖及浸出物质量分数Table 1　Polysaccharide and extracts contents of 10 Dendrobium officinale hybrids flowers

2.2铁皮石斛花氨基酸质量分数

通过酸水解、柱前衍生HPLC对铁皮石斛花中的氨基酸进行分析，得铁皮石斛花液相色谱图（图1）。通过氨基酸指纹图谱对比发现，10个家系花的氨基酸组成基本一致。与标品相比，除了胱氨酸外共检测到了16种氨基酸。铁皮石斛花中含有包括苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸等在内的7种必需氨基酸，另外9种基本氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸和酪氨酸。

图1　氨基酸标样和铁皮石斛花样品色谱图Figure 1　HPLC chromatography of 17 amino acids standard and Dendrobium officinale flowers

由表2可知：铁皮石斛花中总氨基酸平均质量分数为78.52 mg·g-1，其中必需氨基酸平均为30.25 mg·g-1，基本氨基酸平均为48.26 mg·g-1。在所有分析的家系中，83×34的总氨基酸质量分数最高，达到98.02 mg·g-1；1×6，78×69，80×56，68×72等4个家系的总氨基酸质量分数均大于80.00 mg·g-1。1×6，9×66，78×66等3个家系中必需氨基酸占总氨基酸的比例显著高于其他家系（P＜0.05）；83× 34，68×72中基本氨基酸占总氨基酸的比例显著高于其他家系（P＜0.05）。

在10个铁皮石斛家系花检测到的7种必需氨基酸平均质量分数为2.57～8.81 mg·g-1，7种必需氨基酸差异显著（P＜0.05），其中异亮氨酸和亮氨酸是铁皮石斛花中的主要必需氨基酸，显著高于其他5种氨基酸（P＜0.05），平均质量分数分别为8.81 mg· g-1和6.42 mg·g-1，约占必需氨基酸总质量分数的50.00%以上；蛋氨酸平均质量分数最少，仅有1.28 mg·g-1，仅占必需氨基酸的4.24%。

9种基本氨基酸在1.82～12.64 mg·g-1范围内。9种基本氨基酸质量分数差异显著（P＜0.05），其中天冬氨酸显著高于其他8种（P＜0.05），平均为12.64 mg·g-1，占基本氨基酸质量分数的26.02%；其次是谷氨酸（9.94 mg·g-1），占20.47%；组氨酸在基本氨基酸中最低（1.82 mg·g-1），仅占基本氨基酸质量分数的3.75%。

通过表2中不同氨基酸方差分析可知：不同家系氨基酸质量分数差异显著（P＜0.05），且天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸和脯氨酸对不同家系氨基酸组成贡献值最大。

2.3铁皮石斛花多糖、浸出物、氨基酸相关性分析

对铁皮石斛花的多糖、浸出物和氨基酸进行相关性分析，结果见表3。铁皮石斛花中多糖和浸出物之间存在极显著负相关，说明在铁皮石斛花中多糖与浸出物的积累中，随着其中一类成分的增加，另一类成分就会呈下降的趋势。在植物开花期间，多糖作为营养成分会有消耗，因而表现出浸出物的积累增长。多糖、浸出物与氨基酸之间相关性不明显，说明多糖、浸出物的质量分数对氨基酸的营养积累影响较小。此外，必需氨基酸和基本氨基酸、总氨基酸存在极显著正相关，基本氨基酸和总氨基酸之间存在极显著正相关，浸出物与基本氨基酸、必需氨基酸、总氨基酸相关性不明显。

3　讨论

通过对10个铁皮石斛花样本的分析发现，铁皮石斛花中多糖达71.00 mg·g-1，浸出物约为300.00 mg·g-1，多糖质量分数明显低于茎条。不同家系铁皮石斛花多糖、浸出物质量分数差异显著（P＜0.05），说明不同家系亲本来源不同会影响铁皮石斛花多糖、浸出物的合成积累。铁皮石斛花的浸出物质量分数明显高于茎条，周桂芬等［2］曾报道铁皮石斛花中含有丰富的黄酮类化合物，说明黄酮类物质是浸出物的主要组成类型之一。

表2　不同杂交家系铁皮石斛花的氨基酸质量分数Table 2　Amino acids contents of 10 hybrids Dendrobium officinale flowers

本试验采集了10个铁皮石斛家系的样品，样本量丰富，并且采用17种标准氨基酸、柱前衍生HPLC分析的手段进行氨基酸分析，较全面反映铁皮石斛花中氨基酸的分布及质量分数范围。铁皮石斛花中含有丰富的氨基酸，总氨基酸大约是花干质量的7.88%。从铁皮石斛花酸水解样品中共测得16种氨基酸，其中包括7种人体必需氨基酸和9种人体基本氨基酸，分别占花干质量的3.00%和4.80%。其中异亮氨酸、亮氨酸在必需氨基酸中所占比例较高，而在基本氨基酸中天冬氨酸分布较多。龚庆芳等［4］报道，铁皮石斛花中主要氨基酸为精氨酸、脯氨酸，但在本试验所有检测样本中精氨酸与脯氨酸分别是总氨基酸的5.79%和4.54%，而天冬氨酸是总氨基酸的16.10%，与铁皮石斛茎条中的氨基酸分布及质量分数大致相当［11］。另外，在所有样品中未能检测到胱氨酸，同样在铁皮石斛茎中也未检测到胱氨酸［11］，说明胱氨酸在铁皮石斛各部位中积累较少。在10个铁皮石斛家系花样品中，各氨基酸质量分数存在着显著差异（P＜0.05），说明亲本的遗传因素会影响营养成分的积累。

表3　铁皮石斛花中多糖、浸出物与氨基酸的相关性Table 3　Correlation among polysaccharide，extracts，amino acids

铁皮石斛花中多糖与浸出物在合成积累上呈现负相关，多糖、浸出物与氨基酸的营养积累未表现出明显的相关性，必需氨基酸与基本氨基酸呈显著正相关，质量分数差异明显（P＜0.05）。本试验选取10个家系样本进行多糖、浸出物及氨基酸的分析，证实了铁皮石斛花中含有较多的营养及功效成分，与铁皮石斛茎有相似的成分组成，研究结果可作为铁皮石斛花的品质评价的参考。此外，铁皮石斛花在成分分布及质量分数上有独特之处，有必要对它们进行深入研究，发掘其保健功效，对铁皮石斛花的开发利用具有深远的意义。

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Polysaccharides，extracts，and amino acids in hybrid Dendrobium officinale flowers

LÜ Suhua，XU Meng，ZHANG Xinfeng，LIU Jingjing，SI Jinping
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang A&F University，Lin’an 311300，Zhejiang，China）

Dendrobium officinale flowers，which have many non-medicinal folk applications，were studied to determine the distribution and correlation of substances.Using pharmacopeia methods 1）the polysaccharide content，2）the extracts，and 3）the amino acid content were determined by acid hydrolysis and phenyl iso-thiocyanate（PITC）pre-column derivatization combined with a Reversed-phase-high-performance liquid chromatography（RP-HPLC）assay.SPSS 17.0 was used for the analysis.Results showed D.officinale flowers had an average of 71.00 mg·g-1polysaccharides and 300 mg·g-1extracts；16 kinds of amino acids having 7.9%of total amino acids were found.The SPSS 17.0 analysis for the relationship of the three ingredients revealed a negative correlation for the synthetic accumulation between polysaccharide and extracts，but no significant correlation with amino acids.In all，D.officinale flowers had nutritional and functional components including polysaccharides，extracts，and amino acids offering potential health benefits.［Ch，1 fig.3 tab.11 ref.］

Chinese herbology；Dendrobium officinale flowers；amino acids；polysaccharide；extracts；correlation

S567.9

A

2095-0756（2016）05-0749-07

10.11833/j.issn.2095-0756.2016.05.004

2015-09-17；

2015-10-27

浙江省科学技术公益技术应用项目（2015C32097）

吕素华，从事药用植物遗传改良研究。E-mail：1037420126@qq.com。通信作者：张新凤，副教授，博士，从事天然产物及药用植物质量评价。E-mail：zhangxf73@163.com

浙 江 农 林 大 学 学 报，2016，33（5）：749-755

Journal of Zhejiang A＆F University