复方石斛的提取工艺研究

徐小婷　徐应淑　王　森　张云莉

(遵义医学院药剂学教研室，遵义，563006)



复方石斛的提取工艺研究

徐小婷徐应淑王森张云莉

(遵义医学院药剂学教研室，遵义，563006)

目的：优选复方石斛最佳提取工艺。方法：以粗多糖、总黄酮、石斛碱的含量及干膏率为指标，采用正交试验法，利用多指标综合评价的方法及对权重系数的设置，优先最佳提取工艺。结果：复方石斛最佳提取工艺：10倍量的70%乙醇和水各回流120 min。结论：该优化工艺客观可行，稳定可靠，可为复方石斛的工业生产提供实验依据。

复方石斛；粗多糖；总黄酮；石斛碱；提取工艺

复方石斛是本课题组正在研发的治疗高血脂的中药新药，其能有效调节大鼠血脂代谢水平，且能提高机体的抗氧化能力和改善肝组织脂肪变性，具有良好的发展前景。故本实验以粗多糖、总黄酮、石斛碱和得膏率为指标，选择乙醇浓度、提取时间及溶剂用量为考察因素，通过正交设计试验优选复方石斛的提取工艺，为该制剂工业生产提供实验依据。

1　材料

1.1受试药物金钗石斛购于贵州省赤水市信天中药产业开发有限公司，山楂、决明子等药材均购自四川新荷花中药饮片股份有限公司，经遵义医学院药剂教研室王森副教授鉴定均符合《中国药典》2010年版相关要求；D-无水葡萄糖对照品：上海君创生物科技有限公司，批号：7443C；石斛碱对照品：中国食品药品检定研究院，批号：111876-201102；芦丁对照品：国药集团化学试剂公司，批号：F20110406；甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

1.2仪器Agilent-7890A型气相色谱仪：安捷伦科技有限公司；TU-1901双光束紫外可见光分光光度计：北京普系统用仪器有限责任有限公司；TDL-80-2B型低速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；ME204E电子天平：梅特勒-托利多仪器上海有限公司。

2　方法

2.1粗多糖含量测定

2.1.1葡萄糖对照品溶液的制备精密称取D-无水葡萄糖对照品15 mg，加水定容至100 mL。

2.1.2供试品溶液的制备按处方量称取药材20 g提取，精密量取提取液3 mL，加无水乙醇15 mL摇匀，4 ℃放置12 h，3 500 r/min离心10 min，沉淀用20 mL无水乙醇洗涤、离心，沉淀物加水定容至50 mL容量瓶中，过0.45 μm滤膜，待测。

2.1.3测定方法在10 mL的具塞比色管中加入400 μL的葡萄糖对照品溶液，并用蒸馏水补至800 μL，加入800 μL的5%苯酚溶液，再加入2 mL的浓硫酸，混匀，室温放置5 min，沸水中煮15 min，取出，置冰浴中冷却5 min，同法以蒸馏水为空白对照，于400～700 nm波长范围内扫描得到紫外吸收光谱。在最大吸收波长490 nm处测定吸光度为A。

2.1.4标准曲线的绘制精密移取葡萄糖对照品溶液160，240，320，400，480，560，640 μL，按照“2.1.3”项下方法测定吸光度值，并根据A和浓度(c:mg/mL)绘制标准曲线，线性回归方程A=2.9229c-0.003，相关系数r=0.9995，线性范围0.030～0.135 mg/mL。

2.2总黄酮含量测定

2.2.1芦丁对照品溶液的配制精密称取芦丁对照品10 mg，用无水乙醇定容至50 mL量瓶中。

2.2.2供试品溶液的制备取“2.1.2”中的上清液及洗涤液用无水乙醇定容至50 mL量瓶中，过0.45 μm滤膜，待测。

2.2.3测定方法在10 mL的具塞比色管中加入1.0 mL芦丁对照品溶液，并用蒸馏水补至2.4 mL，加入5%亚硝酸钠溶液0.4 mL，混匀，放置6 min，再移取10%硝酸铝溶液0.4 mL，摇匀，放置6 min，再取氢氧化钠试液4 mL，再加水至刻度线，摇匀，放置15 min，同法以蒸馏水为空白对照，于400～700 nm波长范围内扫描得到紫外吸收光谱。在最大吸收波长510 nm处测定吸光度为A。

2.2.4标准曲线的绘制精密移取芦丁对照品溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL，按照“2.2.3”项下方法测定吸光度值，并根据A和浓度(c:mg/mL)绘制标准曲线，线性回归方程为A=3.1291c+0.0464，相关系数r=0.9997，线性范围0.0589～0.2063 mg/mL。

2.3石斛碱含量测定

2.3.1石斛碱对照品溶液的配制精密称取石斛碱对照品5 mg，用无水甲醇定容至50 mL量瓶中。

2.3.2供试品溶液的制备精密量取提取液4 mL于25 mL量瓶中，加入0.05%甲酸的甲醇溶液适量，超声30 min后，放冷，用0.05%甲酸的甲醇溶液定容，混匀，过0.45 um滤膜，待测。

2.3.3阴性溶液的制备称取处方量缺金钗石斛的其他药材提取，按“2.3.2”项下方法制备阴性溶液。

2.3.4色谱条件与系统适应性实验HP-5毛细管柱(5%甲基苯硅氧烷为固定相，柱长为30 m，内径为0.32 mm，膜厚度为0.25 μm)，程序升温：初始温度为80 ℃，以10 ℃/min的速率升温至250 ℃，保持5 min；进样口温度为250 ℃，检测器温度为250 ℃；氢气：30 mL/min，空气：400 mL/min，尾吹：25 mL/min；进样方式：直接进样。按此色谱条件对供试品溶液进行测定，石斛碱色谱峰分离良好，见图1～3。

2.3.5标准曲线的绘制精密移取石斛碱对照品溶液0.5，1，1.5，2，2.5，3 mL，用甲醇定容与10 mL容量瓶中，过滤后分别进样1 μL，测峰面积。以石斛碱的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得出回归方程Y=2.298X-5.528，r=0.9995，线性范围0.005～0.030 mg/mL。

图1　供试品溶液的气相色谱图

图2　石斛碱对照品的气相色谱图

图3　不含金钗石斛的阴性溶液的气相色谱图

2.4浸膏得率的测定[1]精密量取样品液25 mL至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后在105 ℃干燥箱中干燥5 h，于干燥器内冷却至室温，待恒重时精密称定，计算总固体得率。

2.5提取工艺研究

2.5.1因素水平的确设定和正交试验结果通过查找文献[2-5]及前期研究中的单因素试验结果，确定了该复方采用先醇提后水提，并筛选出各因素中的三个水平进行正交设计，选取醇浓度(A)、提取时间(B)、溶剂用量(C)为考察因素，以粗多糖、总黄酮、石斛碱和干膏率的综合评分为指标，综合评分=粗多糖×2.5+总黄酮×3.5+石斛碱×2+干膏率×2。按照处方比例精密称取5味药材，共9份，每份20 g，选择L9(34)正交表进行试验，并按上述方法检测各指标，结果见表1，方差分析见表2。

由直观分析可知，各因素对粗多糖、总黄酮、石斛碱含量及干膏率的影响顺序为A>B>C；以极值最小的D因素为误差项进行方差分析，表明A和B因素对提取工艺具有显著性影响，C因素则无显著性影响，结合生产成本考虑，确定最佳工艺组合为10倍量的70%醇和水各回流120 min。

2.5.2验证实验按优选的提取工艺进行3次重复试验，结果粗多糖、总黄酮、石斛碱及干膏率的平均值分别为20.50 mg/g、34.03 mg/g、55.17 g/g、31.5%，RSD分别为3.39%、1.70%、2.39%、1.2%，表明该工艺稳定可行。

表1　复方石斛提取工艺的实验安排与直观分析结果

表2　正交设计方差分析

注：F0.05(2,2)=19。

3　讨论

在复方石斛中山楂和银杏叶为君药，其黄酮类化合物可通过不同通道，不同位点阻止脂质沉积，到达防治高血脂症状[6-9]，故综合评分时其权重系数为3.5；考虑该复方后续将研制成颗粒剂，而金钗石斛、丹参等中的多糖不仅具有降血脂和护肝作用，还能起到较味功能[10-11]，故权重系数为2.5；金钗石斛是珍稀名贵中药材，为便于控制其在制剂中的含量，防止在生产过程中，贵重药材不投料或少投料的现象发生[12]，选取其石斛碱作为检测指标之一，且权重系数为2；干膏率的大小与服用量的密切相关，因而权重系数为2。此外，考虑以粗多糖、总黄酮、石斛碱的含量为指标，同时兼顾到其均有较成熟、稳定的定量方法[13-14]。

中药提取是生产过程中的关键环节。本文的工艺路线设计充分考虑到处方中各位药材的主要成分，其即包含脂溶性成分又含有水溶性成分，故采用醇提完再水提，使其有效成分得到有效保留，充分发挥药效作用。预实验中对该复方还进行了单因素研究，其中也包括对提取次数的研究，以乙醇和水为溶媒进行分别提取为一次，共提取三次，得出当提取次数增加时，其粗多糖、总黄酮、石斛碱的含量基本不变，因而正交试验中不考虑提取次数这一因素。中药药味较多，其中所含的活性成分复杂，采用多个有效的指标考察其提取工艺，能够更合理、科学地考察提取工艺。本文以总黄酮、粗多糖、石斛碱及干膏率为评价指标，通过其权重的差异进行综合评分优选提取工艺，并进行方差分析，结果显示优选的提取工艺重复性好，可操作性强，该工艺适合工业大生产。

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(2015-06-22收稿责任编辑：张文婷)

The Extraction Process of Compound Dendrobium

Xu Xiaoting, Xu Yingshu, Wang Sen, Zhang Yunli

( Zunyi Medical College, Zunyi 563006, China)

Objective:To establish the optimal extraction technology for compound dendrobium. Methods:To use the content of crude polysaccharide, flavonoids, dendrobine and the extraction rate as indexes and use the method of multi-index comprehensive evaluation and setting of weight coeffficient to choose the best extraction technology by the orthogonal design. Results:The optimum conditions was 10 times of 70% alcohol and water reflux 120min respectively. Conclusion:The optimal extraction is objective, feasible, stable and reliable, which provides experimental basis for industrial production of compound dendrobium.

Compound dendrobium; Crude polysaccharide; Flavonoids; Dendrobine; Extraction process

贵州省赤水市科技局项目(编号：赤中药科合[2013]号)；贵州省中医药管理局项目(编号：QZYY2012-52)

徐小婷(199007—)，女，本科，初级药师，在读研究生，研究方向：新药研究与开发，E-mail：920434389@qq.com

徐应淑(197609—)，女，硕士，教授，主任，研究方向：新药研究与开发，E-mail：527822816@qq.com

R284.2

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.039